Электрофизиологический метод локальной фиксации потенциала (Patch Clamp)

Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) является чрезвычайно полезным инструментом для исследования биофизических свойств ионных каналов, которые контролируют активацию нейронов.

Процедура заключается в прижатии стеклянной микропипетки к клетке для изоляции небольшого «участка» (патча) мембраны, содержащего один или несколько ионных каналов.

Экспериментальная установка дополнительно позволяет ученым «фиксировать» (clamp) электрическую среду изолированного участка, точно контролируя напряжение на клеточной мембране, что, в зависимости от присутствующих ионных каналов, влияет на поток ионов через мембрану и позволяет проводить детальное изучение этих каналов.

В данном видео представлен обзор принципов метода patch clamp, описание этапов, необходимых для проведения эксперимента, и, наконец, некоторые области применения этого метода.

Для начала рассмотрим принципы метода локального прижима (patch-clamp). регистрация методом фиксации потенциала.

Количество положительно и отрицательно заряженных ионов внутри нейрона отличается от их количества снаружи.

Этот дисбаланс создает разность потенциалов, или мембранный потенциал, примерно -70 мВ, что означает, что потенциал внутри мембраны более отрицателен, чем снаружи.

Ионные каналы помогают поддерживать градиент, контролируя перемещение ионов через клеточную мембрану, которое, по сути, представляет собой электрические токи.

Используя метод локальной фиксации потенциала (patch clamp), ученые исследуют природу потенциала и тока.

Установка для метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) включает стеклянную микропипетку, содержащую ионный раствор и хлорсеребряный электрод для измерения напряжений и токов.

Кончик микропипетки имеет полированное отверстие диаметром один микрон, которое охватывает небольшой участок мембраны.

Для устранения фонового шума от ионов в банном растворе между пипеткой и участком мембраны формируется высокоомное уплотнение. Поскольку сопротивление этого уплотнения находится в диапазоне гигаом, его называют гигаомным уплотнением.

Электрод внутри пипетки подключен к усилителю, который может усиливать колебания тока и напряжения, возникающие в результате перемещения ионов через каналы в плазматической мембране.

С помощью усилителя ученые могут фиксировать или искусственно задавать мембранный потенциал на определенных значениях напряжения.

Усилитель регулирует величину тока, который необходимо подать через серебряный электрод для поддержания постоянного напряжения.

Поскольку различные потенциал-зависимые ионные каналы открываются при определенных значениях напряжения, события открытия представлены изменениями профилей измеряемого¬ токи

В качестве альтернативы ученые могут пропускать через электрод ток заданной величины и регистрировать возникающие изменения потенциала. В данной конфигурации «фиксации тока» (current clamp) можно регистрировать потенциалы действия.

Теперь рассмотрим пять основных типов конфигураций метода патч-клампа.

Первая — это конфигурация с прикрепленной мембраной (cell-attached), при которой микропипетка просто плотно прилегает к мембране целой клетки.

Вторая — конфигурация с записью от всей клетки (whole-cell), при которой участок мембраны внутри микропипетки разрушается для обеспечения доступа к внутреннему пространству клетки.

Третья — конфигурация с перфорированным патчем (perforated patch). В этом случае в микропипетку добавляют такие вещества, как антибиотики, чтобы создать в мембране мелкие отверстия, открывающие доступ к цитозолю.

Четвертая конфигурация — патч «внутри-снаружи» (inside-out). Для этого микропипетка сначала формирует плотное прилегание к клетке, а затем быстро оттягивается назад, отрывая фрагмент мембраны и открывая ее внутреннюю поверхность раствору в ванночке.

Это позволяет воздействовать на цитоплазматическую сторону каналов различными химическими веществами, добавляемыми в раствор ванночки.

Наконец, аналогично варианту «внутри-снаружи», патч «снаружи-внутри» (outside-out) начинается с конфигурации whole-cell. Микропипетку медленно извлекают до тех пор, пока фрагмент мембраны не образует выпуклую перегородку на кончике пипетки.

В такой установке внеклеточная сторона канала может подвергаться экспериментальному воздействию.

Теперь, когда мы рассмотрели основные принципы, перейдем к этапам, необходимым для проведения регистрации методом патч-кламп.

Начните с вытягивания микропипеток из боросиликатной стеклянной трубки с помощью пипетовытягивателя.

Затем проведите огневую полировку кончика для достижения подходящего диаметра и сопротивления.

После полировки заполните микропипетку ионным раствором и осторожно встряхните ее, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Затем наденьте микропипетку на электрод, закрепленный в держателе.

После закрепления с помощью шприца создайте в пипетке положительное давление, которое предотвратит попадание других растворов в кончик.

Теперь поместите исследуемые клетки или ткань на предметный столик микроскопа и подведите микропипетку к клетке.

Пока усилитель генерирует тестовые импульсы напряжения, фиксируйте сопротивление, которое увеличится, как только кончик коснется клетки.

Чтобы создать гигаомный слой (seal), осторожно переключите давление с положительного на отрицательное с помощью шприца. Формирование этого слоя приведет к резкому увеличению сопротивления до значений более 1 гигаома.

Теперь, когда конфигурация cell-attached установлена, перейдем к конфигурации whole-cell и проведем эксперимент!

Напомним, что конфигурация whole-cell подразумевает разрыв мембраны.

Разрыв осуществляется путем создания отрицательного давления в микропипетке.

После разрыва мембраны форма тестового импульса будет характеризоваться значительными переходными токами, так как клеточная мембрана теперь работает как конденсатор, который заряжается тестовым импульсом.

Свойства определенного типа ионных каналов в любом given нейроне можно исследовать, фармакологически блокируя активность других типов каналов.

Протокол ступенчатого изменения напряжения используется для изучения токов ионных каналов, вызываемых изменением напряжения до ряда различных удерживающих потенциалов.

Вольт-амперная характеристика (ВАХ) показывает зависимость тока, протекающего через ионный канал, от напряжения и позволяет определить, при каких значениях напряжения канал открыт или закрыт.

Теперь рассмотрим несколько приложений, чтобы понять, как нейробиологи могут использовать этот метод.

Иногда ионные каналы нейронов можно изучать в бесклеточной среде.

В данном случае ученые добавили белки ионных каналов в искусственную липидную мембрану, чтобы исследовать эти каналы изолированно.

Затем эти каналы можно подвергнуть воздействию экспериментальных молекул, таких как капсаицин, полученный из острого перца, чтобы изучить их влияние на активность каналов.

Поскольку ионные каналы обращены к внеклеточной среде и существенно влияют на функции клеток, они являются отличными мишенями для лекарственных препаратов. При добавлении тестовых соединений в микропипетку или в раствор ванны метод patch clamp позволяет напрямую проверить воздействие препаратов, таких как никотин, на нейронную активность. Принцип создания герметичного уплотнения с высоким сопротивлением за счет приложения отрицательного давления был даже использован для создания устройств высокопроизводительного скрининга, которые позволяют одновременно регистрировать активность множества клеток для поиска новых лекарств.

Метод whole-cell patch clamp является ценным инструментом для измерения ответа отдельных клеток на стимулы.

Кроме того, парные записи могут быть использованы для изучения влияния разрядов нейронов на возбудимые клетки-мишени, например, на мышцы. В данном примере whole-cell patch clamp используется для стимуляции разрядов мотонейрона, в то время как одновременно регистрируется активность мышечного волокна, которое он контролирует. Наблюдается четкая взаимосвязь между возбуждением нейрона и мышечной активностью.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по методу локальной фиксации потенциала (patch clamp), в котором были рассмотрены принципы данной техники и этапы проведения эксперимента.

Благодаря исключительной временной чувствительности к изменениям напряжения и токов, метод patch clamp по-прежнему будет играть ключевую роль в изучении биофизики каналов и нейронов.

Спасибо за просмотр!