Электрофизиологический метод локальной фиксации потенциала (Patch Clamp)
Мембраны нейронов содержат ионные каналы, которые контролируют перемещение заряда внутрь и из клетки, регулируя тем самым возбуждение нейронов. Одним…
Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) является чрезвычайно полезным инструментом для исследования биофизических свойств ионных каналов, которые контролируют активацию нейронов.
Процедура заключается в прижатии стеклянной микропипетки к клетке для изоляции небольшого «участка» (патча) мембраны, содержащего один или несколько ионных каналов.
Экспериментальная установка дополнительно позволяет ученым «фиксировать» (clamp) электрическую среду изолированного участка, точно контролируя напряжение на клеточной мембране, что, в зависимости от присутствующих ионных каналов, влияет на поток ионов через мембрану и позволяет проводить детальное изучение этих каналов.
В данном видео представлен обзор принципов метода patchclamp, описание этапов, необходимых для проведения эксперимента, и, наконец, некоторые области применения этого метода.
Для начала рассмотрим принципы метода локального прижима (patch-clamp).регистрация методом фиксации потенциала.
Количество положительно и отрицательно заряженных ионов внутри нейрона отличается от их количества снаружи.
Этот дисбаланс создает разность потенциалов, или мембранный потенциал, примерно -70 мВ, что означает, что потенциал внутри мембраны более отрицателен, чем снаружи.
Ионные каналы помогают поддерживать градиент, контролируя перемещение ионов через клеточную мембрану, которое, по сути, представляет собой электрические токи.
Используя метод локальной фиксации потенциала (patch clamp), ученые исследуют природу потенциала и тока.
Установка для метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) включает стеклянную микропипетку, содержащую ионный раствор и хлорсеребряный электрод для измерения напряжений и токов.
Кончик микропипетки имеет полированное отверстие диаметром один микрон, которое охватывает небольшой участок мембраны.
Для устранения фонового шума от ионов в банном растворе между пипеткой и участком мембраны формируется высокоомное уплотнение. Поскольку сопротивление этого уплотнения находится в диапазоне гигаом, его называют гигаомным уплотнением.
Электрод внутри пипетки подключен к усилителю, который может усиливать колебания тока и напряжения, возникающие в результате перемещения ионов через каналы в плазматической мембране.
С помощью усилителя ученые могут фиксировать или искусственно задавать мембранный потенциал на определенных значениях напряжения.
Усилитель регулирует величину тока, который необходимо подать через серебряный электрод для поддержания постоянного напряжения.
Поскольку различные потенциал-зависимые ионные каналы открываются при определенных значениях напряжения, события открытия представлены изменениями профилей измеряемого¬ токи
В качестве альтернативы ученые могут пропускать через электрод ток заданной величины и регистрировать возникающие изменения потенциала.В данной конфигурации «фиксации тока» (current clamp) можно регистрировать потенциалы действия.
Теперь рассмотрим пять основных типов конфигураций метода патч-клампа.
Первая — это конфигурация с прикрепленной мембраной (cell-attached), при которой микропипетка просто плотно прилегает к мембране целой клетки.
Вторая — конфигурация с записью от всей клетки (whole-cell), при которой участок мембраны внутри микропипетки разрушается для обеспечения доступа к внутреннему пространству клетки.
Третья — конфигурация с перфорированным патчем (perforated patch). В этом случае в микропипетку добавляют такие вещества, как антибиотики, чтобы создать в мембране мелкие отверстия, открывающие доступ к цитозолю.
Четвертая конфигурация — патч «внутри-снаружи» (inside-out). Для этого микропипетка сначала формирует плотное прилегание к клетке, а затем быстро оттягивается назад, отрывая фрагмент мембраны и открывая ее внутреннюю поверхность раствору в ванночке.
Это позволяет воздействовать на цитоплазматическую сторону каналов различными химическими веществами, добавляемыми в раствор ванночки.
Наконец, аналогично варианту «внутри-снаружи», патч «снаружи-внутри» (outside-out) начинается с конфигурации whole-cell. Микропипетку медленно извлекают до тех пор, пока фрагмент мембраны не образует выпуклую перегородку на кончике пипетки.
В такой установке внеклеточная сторона канала может подвергаться экспериментальному воздействию.
Теперь, когда мы рассмотрели основные принципы, перейдем к этапам, необходимым для проведения регистрации методом патч-кламп.
Начните с вытягивания микропипеток из боросиликатной стеклянной трубки с помощью пипетовытягивателя.
Затем проведите огневую полировку кончика для достижения подходящего диаметра и сопротивления.
После полировки заполните микропипетку ионным раствором и осторожно встряхните ее, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Затем наденьте микропипетку на электрод, закрепленный в держателе.
После закрепления с помощью шприца создайте в пипетке положительное давление, которое предотвратит попадание других растворов в кончик.
Теперь поместите исследуемые клетки или ткань на предметный столик микроскопа и подведите микропипетку к клетке.
Пока усилитель генерирует тестовые импульсы напряжения, фиксируйте сопротивление, которое увеличится, как только кончик коснется клетки.
Чтобы создать гигаомный слой (seal), осторожно переключите давление с положительного на отрицательное с помощью шприца.Формирование этого слоя приведет к резкому увеличению сопротивления до значений более 1 гигаома.
Теперь, когда конфигурация cell-attached установлена, перейдем к конфигурации whole-cell и проведем эксперимент!
Напомним, что конфигурация whole-cell подразумевает разрыв мембраны.
Разрыв осуществляется путем создания отрицательного давления в микропипетке.
После разрыва мембраны форма тестового импульса будет характеризоваться значительными переходными токами, так как клеточная мембрана теперь работает как конденсатор, который заряжается тестовым импульсом.
Свойства определенного типа ионных каналов в любом given нейроне можно исследовать, фармакологически блокируя активность других типов каналов.
Протокол ступенчатого изменения напряжения используется для изучения токов ионных каналов, вызываемых изменением напряжения до ряда различных удерживающих потенциалов.
Вольт-амперная характеристика (ВАХ) показывает зависимость тока, протекающего через ионный канал, от напряжения и позволяет определить, при каких значениях напряжения канал открыт или закрыт.
Теперь рассмотрим несколько приложений, чтобы понять, как нейробиологи могут использовать этот метод.
Иногда ионные каналы нейронов можно изучать в бесклеточной среде.
В данном случае ученые добавили белки ионных каналов в искусственную липидную мембрану, чтобы исследовать эти каналы изолированно.
Затем эти каналы можно подвергнуть воздействию экспериментальных молекул, таких как капсаицин, полученный из острого перца, чтобы изучить их влияние на активность каналов.
Поскольку ионные каналы обращены к внеклеточной среде и существенно влияют на функции клеток, они являются отличными мишенями для лекарственных препаратов. При добавлении тестовых соединений в микропипетку или в раствор ванны метод patch clamp позволяет напрямую проверить воздействие препаратов, таких как никотин, на нейронную активность. Принцип создания герметичного уплотнения с высоким сопротивлением за счет приложения отрицательного давления был даже использован для создания устройств высокопроизводительного скрининга, которые позволяют одновременно регистрировать активность множества клеток для поиска новых лекарств.
Метод whole-cell patch clamp является ценным инструментом для измерения ответа отдельных клеток на стимулы.
Кроме того, парные записи могут быть использованы для изучения влияния разрядов нейронов на возбудимые клетки-мишени, например, на мышцы. В данном примере whole-cell patch clamp используется для стимуляции разрядов мотонейрона, в то время как одновременно регистрируется активность мышечного волокна, которое он контролирует. Наблюдается четкая взаимосвязь между возбуждением нейрона и мышечной активностью.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по методу локальной фиксации потенциала (patch clamp), в котором были рассмотрены принципы данной техники и этапы проведения эксперимента.
Благодаря исключительной временной чувствительности к изменениям напряжения и токов, метод patch clamp по-прежнему будет играть ключевую роль в изучении биофизики каналов и нейронов.
Спасибо за просмотр!
Метод локальной фиксации потенциала (patch clamp) является чрезвычайно полезным инструментом для исследования биофизических свойств ионных каналов, которые контролируют активацию нейронов.
Процедура заключается в прижатии стеклянной микропипетки к клетке для изоляции небольшого «участка» (патча) мембраны, содержащего один или несколько ионных каналов.
Экспериментальная установка дополнительно позволяет ученым «фиксировать» (clamp) электрическую среду изолированного участка, точно контролируя напряжение на клеточной мембране, что, в зависимости от присутствующих ионных каналов, влияет на поток ионов через мембрану и позволяет проводить детальное изучение этих каналов.
В данном видео представлен обзор принципов метода patch clamp, описание этапов, необходимых для проведения эксперимента, и, наконец, некоторые области применения этого метода.
Для начала рассмотрим принципы метода локального прижима (patch-clamp). регистрация методом фиксации потенциала.
Количество положительно и отрицательно заряженных ионов внутри нейрона отличается от их количества снаружи.
Этот дисбаланс создает разность потенциалов, или мембранный потенциал, примерно -70 мВ, что означает, что потенциал внутри мембраны более отрицателен, чем снаружи.
Ионные каналы помогают поддерживать градиент, контролируя перемещение ионов через клеточную мембрану, которое, по сути, представляет собой электрические токи.
Используя метод локальной фиксации потенциала (patch clamp), ученые исследуют природу потенциала и тока.
Установка для метода локальной фиксации потенциала (patch clamp) включает стеклянную микропипетку, содержащую ионный раствор и хлорсеребряный электрод для измерения напряжений и токов.
Кончик микропипетки имеет полированное отверстие диаметром один микрон, которое охватывает небольшой участок мембраны.
Для устранения фонового шума от ионов в банном растворе между пипеткой и участком мембраны формируется высокоомное уплотнение. Поскольку сопротивление этого уплотнения находится в диапазоне гигаом, его называют гигаомным уплотнением.
Электрод внутри пипетки подключен к усилителю, который может усиливать колебания тока и напряжения, возникающие в результате перемещения ионов через каналы в плазматической мембране.
С помощью усилителя ученые могут фиксировать или искусственно задавать мембранный потенциал на определенных значениях напряжения.
Усилитель регулирует величину тока, который необходимо подать через серебряный электрод для поддержания постоянного напряжения.
Поскольку различные потенциал-зависимые ионные каналы открываются при определенных значениях напряжения, события открытия представлены изменениями профилей измеряемого¬ токи
В качестве альтернативы ученые могут пропускать через электрод ток заданной величины и регистрировать возникающие изменения потенциала. В данной конфигурации «фиксации тока» (current clamp) можно регистрировать потенциалы действия.
Теперь рассмотрим пять основных типов конфигураций метода патч-клампа.
Первая — это конфигурация с прикрепленной мембраной (cell-attached), при которой микропипетка просто плотно прилегает к мембране целой клетки.
Вторая — конфигурация с записью от всей клетки (whole-cell), при которой участок мембраны внутри микропипетки разрушается для обеспечения доступа к внутреннему пространству клетки.
Третья — конфигурация с перфорированным патчем (perforated patch). В этом случае в микропипетку добавляют такие вещества, как антибиотики, чтобы создать в мембране мелкие отверстия, открывающие доступ к цитозолю.
Четвертая конфигурация — патч «внутри-снаружи» (inside-out). Для этого микропипетка сначала формирует плотное прилегание к клетке, а затем быстро оттягивается назад, отрывая фрагмент мембраны и открывая ее внутреннюю поверхность раствору в ванночке.
Это позволяет воздействовать на цитоплазматическую сторону каналов различными химическими веществами, добавляемыми в раствор ванночки.
Наконец, аналогично варианту «внутри-снаружи», патч «снаружи-внутри» (outside-out) начинается с конфигурации whole-cell. Микропипетку медленно извлекают до тех пор, пока фрагмент мембраны не образует выпуклую перегородку на кончике пипетки.
В такой установке внеклеточная сторона канала может подвергаться экспериментальному воздействию.
Теперь, когда мы рассмотрели основные принципы, перейдем к этапам, необходимым для проведения регистрации методом патч-кламп.
Начните с вытягивания микропипеток из боросиликатной стеклянной трубки с помощью пипетовытягивателя.
Затем проведите огневую полировку кончика для достижения подходящего диаметра и сопротивления.
После полировки заполните микропипетку ионным раствором и осторожно встряхните ее, чтобы удалить пузырьки воздуха.
Затем наденьте микропипетку на электрод, закрепленный в держателе.
После закрепления с помощью шприца создайте в пипетке положительное давление, которое предотвратит попадание других растворов в кончик.
Теперь поместите исследуемые клетки или ткань на предметный столик микроскопа и подведите микропипетку к клетке.
Пока усилитель генерирует тестовые импульсы напряжения, фиксируйте сопротивление, которое увеличится, как только кончик коснется клетки.
Чтобы создать гигаомный слой (seal), осторожно переключите давление с положительного на отрицательное с помощью шприца. Формирование этого слоя приведет к резкому увеличению сопротивления до значений более 1 гигаома.
Теперь, когда конфигурация cell-attached установлена, перейдем к конфигурации whole-cell и проведем эксперимент!
Напомним, что конфигурация whole-cell подразумевает разрыв мембраны.
Разрыв осуществляется путем создания отрицательного давления в микропипетке.
После разрыва мембраны форма тестового импульса будет характеризоваться значительными переходными токами, так как клеточная мембрана теперь работает как конденсатор, который заряжается тестовым импульсом.
Свойства определенного типа ионных каналов в любом given нейроне можно исследовать, фармакологически блокируя активность других типов каналов.
Протокол ступенчатого изменения напряжения используется для изучения токов ионных каналов, вызываемых изменением напряжения до ряда различных удерживающих потенциалов.
Вольт-амперная характеристика (ВАХ) показывает зависимость тока, протекающего через ионный канал, от напряжения и позволяет определить, при каких значениях напряжения канал открыт или закрыт.
Теперь рассмотрим несколько приложений, чтобы понять, как нейробиологи могут использовать этот метод.
Иногда ионные каналы нейронов можно изучать в бесклеточной среде.
В данном случае ученые добавили белки ионных каналов в искусственную липидную мембрану, чтобы исследовать эти каналы изолированно.
Затем эти каналы можно подвергнуть воздействию экспериментальных молекул, таких как капсаицин, полученный из острого перца, чтобы изучить их влияние на активность каналов.
Поскольку ионные каналы обращены к внеклеточной среде и существенно влияют на функции клеток, они являются отличными мишенями для лекарственных препаратов. При добавлении тестовых соединений в микропипетку или в раствор ванны метод patch clamp позволяет напрямую проверить воздействие препаратов, таких как никотин, на нейронную активность. Принцип создания герметичного уплотнения с высоким сопротивлением за счет приложения отрицательного давления был даже использован для создания устройств высокопроизводительного скрининга, которые позволяют одновременно регистрировать активность множества клеток для поиска новых лекарств.
Метод whole-cell patch clamp является ценным инструментом для измерения ответа отдельных клеток на стимулы.
Кроме того, парные записи могут быть использованы для изучения влияния разрядов нейронов на возбудимые клетки-мишени, например, на мышцы. В данном примере whole-cell patch clamp используется для стимуляции разрядов мотонейрона, в то время как одновременно регистрируется активность мышечного волокна, которое он контролирует. Наблюдается четкая взаимосвязь между возбуждением нейрона и мышечной активностью.
Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по методу локальной фиксации потенциала (patch clamp), в котором были рассмотрены принципы данной техники и этапы проведения эксперимента.
Благодаря исключительной временной чувствительности к изменениям напряжения и токов, метод patch clamp по-прежнему будет играть ключевую роль в изучении биофизики каналов и нейронов.
Спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.