1.2: Электрофизиология патч-зажима

Запись с помощью патч-хомута является чрезвычайно полезным методом исследования биофизических свойств ионных каналов, которые контролируют активацию нейронов.

Процедура включает в себя прижатие стеклянной микропипетки к клетке для того, чтобы изолировать небольшой «участок» мембраны, который содержит один или несколько ионных каналов.

Кроме того, экспериментальная установка позволяет ученым «зажимать» электрическую среду заплатанной области, точно контролируя напряжение на клеточной мембране, которое, в зависимости от присутствующих ионных каналов, влияет на поток ионов через мембрану и позволяет проводить сложное изучение этих каналов.

В этом видео представлен обзор принципов, лежащих в основе техники патч-зажима, описание шагов, необходимых для проведения эксперимента, и, наконец, некоторые из применений этого метода.

Во-первых, давайте рассмотрим принципы, лежащие в основе записи патч-клэмпа.

Количество положительных и отрицательно заряженных ионов внутри нейрона отличается от количества, обнаруженного снаружи.

Этот дисбаланс приводит к разнице напряжений, или мембранному потенциалу, около -70 мВ, что означает, что внутренняя часть более отрицательна, чем внешняя.

Ионные каналы помогают поддерживать градиент, контролируя движение ионов через клеточную мембрану, которые по сути являются электрическими токами.

Используя технику патч-зажима, ученые задаются вопросами о природе потенциала и тока.

В комплект установки для патч-зажимов входит стеклянная микропипетка, которая содержит как ионный раствор, так и хлорированный серебряный электрод для измерения напряжения и тока.

Кончик микропипетки имеет полированное отверстие размером в один микрон, которое заключает в себе небольшой участок мембраны.

Для устранения фонового шума от ионов в растворе ванны между пипеткой и мембранным заплаткой образуется высокопрочное уплотнение. Поскольку сопротивление уплотнения находится в гигаомном диапазоне, оно известно как гигаомное уплотнение.

Электрод внутри пипетки подключен к усилителю, который может усиливать колебания тока и напряжения, являющиеся результатом движения ионов по каналам плазматической мембраны.

С помощью усилителя ученые могут зажимать или искусственно устанавливать мембранный потенциал на определенные напряжения.

Усилитель регулирует, сколько тока должно быть добавлено через серебряный электрод, чтобы поддерживать постоянное напряжение.

Поскольку различные потенциал-зависимые ионные каналы открываются при определенных напряжениях, события размыкания представлены вариациями профилей измеряемых токов.

В качестве альтернативы ученые могут пропускать определенный ток через электрод и регистрировать результирующие изменения потенциала. В этой конфигурации "токового зажима" могут быть зарегистрированы потенциалы действия.

Давайте теперь рассмотрим пять основных типов конфигураций патч-зажимов.

Во-первых, это конфигурация, прикрепленная к клетке, при которой микропипетка просто приклеивается к мембране интактной клетки.

Во-вторых, это конфигурация целой клетки, при которой мембрана внутри микропипетки разрывается, чтобы обеспечить доступ к внутренней части клетки.

В-третьих, конфигурация перфорированного патча. Здесь в микропипетку добавляются химические вещества, такие как антибиотики, чтобы сделать небольшие отверстия в мембране, обеспечивающие доступ к цитозолю.

Четвертая конфигурация — патч «изнутри наружу». Для этого микропипетка сначала образует уплотнение с клеткой, а затем быстро оттягивается, отрывая кусочек мембраны и подвергая внутреннюю поверхность воздействию раствора для ванны.

Это позволяет цитоплазматической стороне каналов подвергаться воздействию различных химических веществ, применяемых к ванне.

Наконец, как и в случае с «изнутри-наружу», патч «снаружи-наружу» начинается как конфигурация с целыми ячейками. Микропипетка медленно извлекается до тех пор, пока кусочек мембраны не образует выпуклое уплотнение поперек наконечника.

В этой конфигурации внеклеточная поверхность канала может быть подвергнута экспериментальному лечению.

Теперь, когда мы рассмотрели принципы, давайте рассмотрим шаги, необходимые для выполнения записи патч-зажима.

Начните с того, что натяните пробирку из боросиликатного стекла в микропипетки с помощью съемника для пипетки.

Далее огневую полировку наконечника для получения соответствующего диаметра и прочности.

После полировки наполните микропипетку ионным раствором и осторожно похлопайте, чтобы удалить пузырьки воздуха.

Затем наденьте микропипетку на электрод, прикрепленный к держателю.

После прикрепления с помощью шприца надавите на пипетку, чтобы предотвратить попадание других растворов в наконечник.

Теперь поместите интересующие вас клетки или ткани на предметный столик микроскопа и переместите микропипетку к клетке.

Когда усилитель генерирует импульсы испытательного напряжения, запишите сопротивление, которое увеличится при касании наконечника элемента.

Чтобы сформировать гигаомное уплотнение, осторожно переключитесь с положительного давления на отрицательное с помощью шприца. Образование уплотнения приведет к быстрому увеличению сопротивления до более чем 1 гигаом.

Теперь, когда конфигурация, подключенная к клетке, установлена, давайте преобразуем ее в конфигурацию целой клетки и проведем эксперимент!

Напомним, что цельноклеточная конфигурация — это когда мембрана разрывается.

Разрыв осуществляется путем добавления отрицательного давления в микропипетку.

Как только мембрана разорвется, форма тестового импульса будет иметь большие переходные процессы тока, так как клеточная мембрана теперь действует как конденсатор, который заряжается тестовым импульсом.

Свойства одного типа ионного канала в любом конкретном нейроне могут быть исследованы путем фармакологического блокирования активности других типов каналов.

Протокол шага напряжения используется для изучения токов ионных каналов, вызванных повышением напряжения до ряда различных удерживающих потенциалов.

Вольт-амперная кривая или кривая IV показывает зависимости тока от напряжения, протекающего через ионный канал, и дает представление о том, при каких напряжениях канал разомкнут или замкнут.

Давайте теперь рассмотрим несколько приложений, чтобы изучить, что нейробиологи могут сделать с помощью этой техники.

Иногда ионные каналы, обнаруженные в нейронах, могут быть изучены в неклеточной среде.

Здесь ученые добавили белки ионных каналов к искусственной липидной мембране, чтобы изучить эти каналы по отдельности.

Затем эти каналы могут быть подвергнуты воздействию экспериментальных молекул, таких как капсаицин, полученный из острого перца, для изучения их влияния на активность каналов.

Поскольку они подвергаются воздействию внеклеточной среды и значительно влияют на клеточную функцию, ионные каналы являются отличными мишенями для лекарств. Когда тестируемые соединения добавляются в микропипетки или растворы для ванны, записи с помощью пластыря можно использовать для непосредственного тестирования влияния лекарств, таких как никотин, на нейронную активность. Принцип приложения отрицательного давления для формирования высокопрочного уплотнения был применен даже для создания высокопроизводительных устройств, которые могут одновременно записывать данные из нескольких ячеек для скрининга лекарственных препаратов.

Патч-зажим для целых клеток является ценным инструментом для измерения реакции отдельных клеток на раздражители.

Кроме того, парные записи могут быть использованы для исследования влияния возбуждения нейронов на возбудимые клетки-мишени, такие как мышцы. В этом примере цельноклеточный зажим используется для стимуляции возбуждения моторного нейрона, в то время как записи одновременно берутся от мышечного волокна, которое он контролирует. Наблюдаются четкие взаимосвязи между возбуждением нейронов и мышечной активностью.

Вы только что посмотрели введение JoVE в запись патч-клэмпов, где были рассмотрены принципы, лежащие в основе техники, и шаги при проведении эксперимента.

Благодаря своей исключительной временной чувствительности к изменениям напряжения и тока, запись с помощью патч-клещей будет продолжать играть важную роль в понимании биофизики каналов и нейронов.

Спасибо за просмотр!