Руководство по современной количественной Люминесцентная Вестерн-блоттинга с устранения неисправностей стратегий

Целью этой процедуры является обнаружение и точная количественная оценка относительного содержания специфических белков в сложном биологическом образце с помощью количественного флуоресцентного скручивания и блоттинга. Это достигается за счет первого электрофлуоресцентного разделения белковых экстрактов с использованием сборного градиентного геля. На втором этапе эквивалентная белковая нагрузка проверяется по всем полосам образца путем нанесения общего белкового окрашивания, а затем используется полусухая система быстрого переноса глазной блокады для переноса образцов на мембрану A-P-V-D-F.

Наконец, белки зондируют специфическими первичными антителами, за которыми следуют соответствующие флуоресцентные меченые вторичные антитела, чтобы облегчить их чувствительное, надежное и линейное обнаружение в инфракрасном диапазоне и на дальних красных длинах волн. В конечном счете, количественное флуоресцентное цветение может быть использовано для воспроизводимого обнаружения, визуализации и точного количественного определения большого количества мембраносвязанных и растворимых белков в широком спектре образцов тканей. Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как визуализация на основе ECL, заключается в том, что он обеспечивает большую чувствительность с повышенной точностью в широком линейном масштабе для действительно количественного считывания.

Затем центрифугируйте лизат клетки в течение 20 минут при температуре 20 000 раз G при четырех градусах Цельсия. Затем переложите сат, содержащий солюбилизированные белки, в чистую микроцентрифужную пробирку и храните гранулы и фракции надосадочной жидкости при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока это не потребуется. После определения концентрации белка супината перенесите 15 микрограммов белка на образец в новые микроцентрифужные пробирки.

Затем доведите итоговый объем каждого образца до 10 микролитров с помощью дистиллированной воды и добавьте пять микролитров загрузочного буфера Forex. Тщательно перемешайте клеточные растворы путем вортекса, а затем нагрейте образцы до 98 градусов Цельсия в течение двух минут, чтобы денатурировать белки. После денатурации добавьте по три микролитра соответствующего стандарта молекулярной массы в первую лунку каждого из экспериментальных и контрольных гелей.

После этого после электрофореза загрузите по 10 микролитров каждого образца в соответствующие последующие лунки. С помощью гелевого ножа высвободите гели из кассеты и удалите лунки и подножие геля. Отметьте гель, чтобы облегчить последующую ориентацию.

Затем для определения эквивалентной белковой нагрузки сцеживают примерно 30 миллилитров белкового красителя в квадратную чашку Петри размером 12 на 12 сантиметров и помещают в пятно контрольный слой нагрузки, следя за тем, чтобы раствор покрывал весь гель. Осторожно перемешайте гель в течение как минимум одного часа при комнатной температуре, а затем выбросьте белковое пятно и промойте гель три раза в дистиллированной воде перед визуализацией глазной блокады. Два полусухих быстрых переноса белка После электрофореза подготовьте нижний стек переноса, сняв крышку фольги и предварительно смочив мембрану проточным буфером непосредственно из резервуара с гелем.

В это же время снова смочите фильтровальную бумагу дистиллированной водой. Затем нанесите экспериментальный гель на подготовленную нижнюю стопку для переноса, а затем положите на гель фильтровальную бумагу для предварительной работы и скатайте их обоими, чтобы убедиться, что между слоями не образовались пузырьки. Положите верхний стек поверх фильтровальной бумаги и нижний стек.

Затем скатайте сэндвич с трансферной стопкой, чтобы удалить пузырьки воздуха. Вставьте губку из комплекта для переноса на впитывающую прокладку и поместите сэндвич для стека в специально отведенное место. Затем надежно закройте крышку и запустите I блок два, перенося белки в течение семи минут по третьей программе.

Когда программа будет завершена, извлеките трансферный стек из машины для глазных блоков и снимите верхний трансферный стек и отфильтруйте слои бумаги, обнажив гель на нижнем трансферном стеке. Используйте скальпель для разреза вокруг геля, стараясь сделать треугольный надрез в целях ориентации на мембране после обрезки мембраны, чтобы проверить эффективность переноса белкового пятна, гель, как только что продемонстрировано, а затем быстро переместите мембрану в чистую 50-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров PBS для первого из трех. Пятиминутные стирки на механическом валике. После третьей промывки выбросьте буфер для промывки и инкубируйте мембрану в неразбавленном блокирующем буфере не менее 30 минут при комнатной температуре.

Далее инкубируют мембрану в первичном антителе, разведенном в пяти миллилитрах блокирующего буфера и 0,1 между 20 в течение ночи при четырех градусах Цельсия при постоянном перемешивании. На следующее утро после удаления первичного раствора антитела промойте мембрану шесть раз в течение пяти минут в PBS, как показано только что на рисунке. Затем инкубируйте мембрану в темноте с флуоресцентными мечеными вторичными антителами, расширенными в пяти миллилитрах блокирующего буфера и 0,1% от 20 до 20 при постоянном перемешивании, после чего следует шесть пятиминутных промываний PBS для всей визуализации.

Во-первых, войдите в компьютер и сделайте имидж-сканер. Затем откройте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы получить изображение западного блота. Сначала откройте крышку тепловизора и налейте на стакан небольшое количество PBS.

В нижнем левом углу тепловизора поместите мембрану поверх PBS, убедившись, что она перпендикулярна оси тепловизора, а между мембраной и осью сетки остается зазор в один сантиметр. Прокатайте мембрану, чтобы убедиться, что между стеклом и мембраной не образовались пузырьки, а затем подсчитайте количество квадратов, которые мембрана занимает по осям x и y. Далее закройте крышку тепловизора и введите количество квадратов в компьютерную программу.

Выберите подходящий инфракрасный канал и подходящую интенсивность, а затем запустите сканирование, чтобы визуализировать общее окрашивание белка в геле для контроля нагрузки. Восстановите гель и тепловизор, как только что было продемонстрировано для экспериментальной мембраны, а затем выберите канал 700. Установите интенсивность на пять и начните сканирование.

Для количественной оценки данных сканирования. Начните с регулировки яркости и контрастности отсканированного файла для получения наилучшего качества изображения, поворачивая изображения, необходимые для достижения желаемой ориентации. Далее выберите прямоугольник в меню фигур и с его помощью нарисуйте прямоугольник вокруг всей полосы.

В образце полосы первая. Скопируйте и вставьте фигуру вокруг первой полосы в образец второй полосы. Убедившись, что фоновое измерение не включает сигнал на следующей полосе, нарисуйте прямоугольник вокруг каждой полосы для остальных полос выборки.

Затем выведите сигнал для таблицы фигур для каждого прямоугольника, нарисованного в произвольных флуоресцентных единицах, и сохраните изображение в виде жесткой желчи. Существует ряд мер контроля, которые имеют решающее значение для обеспечения сбора точных данных во время количественного флуоресцентного вестерн-блоттинга. Например, желательно включить положительные контрольные пробы.

Во-вторых, важно оптимизировать время переноса, чтобы гарантировать эквивалентное перемещение высокомолекулярных и низкомолекулярных белков от геля к мембране. В-третьих, необходимо определить соответствующие первичные и вторичные разведения антител, чтобы избежать неправильной интерпретации интересующих белков из-за неспецифического полосирования, как показано на этих изображениях. В-четвертых, важно рассмотреть, может ли потребоваться вторичное антитело, выращенное у другого вида хозяина, особенно в тех случаях, когда ожидаемая белковая полоса не обнаруживается.

В-пятых, производство геля для контроля нагрузки может подтвердить равномерность загрузки образца. В сочетании с анализом общего белка гель может быть использован для сравнения и количественной оценки белковой нагрузки в каждой полосе в различных диапазонах молекулярной массы, измеренных для каждого образца. Наконец, этот метод позволяет проводить зачистку и повторное зондирование мембран с большей гибкостью, чем люминесценция кеми, благодаря таким факторам, как повышенная чувствительность, уменьшенный фон, двойное цветовое детектирование и стабильность мембраны в условиях длительного хранения.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать количественное флуоресцентное построение западных графиков для обнаружения и точного количественного определения интересующих белков, а также как устранять распространенные проблемы, которые могут возникнуть при выполнении этого метода.