Оценка жизнеспособности человеческого жира инъекции голым мышам с Micro-компьютерной томографии

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы описать мышиную модель, которая использует микрокомпьютерную томографию для сравнения удержания объема между отсроченными методами подготовки и доставки жирового трансплантата. Это достигается путем предварительной обработки человеческого липоаспирата для получения жира, готового к пересадке. Вторым шагом является размещение жировых трансплантатов в кожу головы голых мышей CD one thymic

Затем выживаемость жирового трансплантата еженедельно анализируется с помощью компьютерной томографии мышей, реконструкции изображений и количественной оценки удержания объема. Заключительным этапом является проведение жировых трансплантатов по истечении восьми недель и сравнение их по весу и гистологии. В конечном счете, микрокомпьютерная томография и гистология используются, чтобы показать различия в качестве и выживаемости жирового трансплантата.

Основное преимущество этой методики по сравнению с существующими методами, такими как взвешивание жировых трансплантатов, заключается в том, что она позволяет визуализировать и объективно количественно оценить объем жировых трансплантатов в несколько временных точек после первоначальной трансплантации без необходимости жертвовать исследуемым животным. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы начали использовать микрокомпьютерную томографию для анализа дефектов кальвы. Значение этого метода заключается в том, что он предлагает хирургическую модель для всех исследований, оценивающих жировой трансплантат, удержание и жизнеспособность.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что удержание жирового трансплантата в правильном положении над кожей головы является сложной задачей. Визуальная демонстрация этой техники имеет решающее значение, поскольку этапы пересадки и реконструкции трудно освоить, потому что существует множество этапов, на которых небольшое отклонение в технике может изменить результат. Используя процедуру Коулмана, получить жировую ткань человека из области живота, бока и бедра здоровых пациенток, проходящих плановую липосакцию.

Чтобы обработать липосаспират для пересадки, начните с того, что дайте жиру осесть в течение 30 минут. Липоаспират обычно располагается в трех слоях: масло наверху, жир посередине и кровь внизу. Отсадите и выбросьте верхний слой масла, за которым следует нижний слой крови.

Чтобы дополнительно удалить оставшуюся тумесцентную жидкость или клеточный мусор, центрифугируйте жир в течение пяти минут при температуре 350 G и четырех градусах Цельсия. После центрифугирования отсасывают нижний слой крови и верхний слой масла. Чтобы рассчитать количество жира, необходимое для пересадки, как описано в текстовом протоколе, для выполнения пересадки жира получите самку гомозиготной КД одной голой мыши.

Для экспериментального исследования выбирайте мышей в возрасте от 8 до 12 недель, чтобы вызвать анестезию. Поместите мышь в коробку с 2,5%-ной изофторсодержащей кислородной смесью со скоростью два литра в минуту примерно на 10 минут, когда частота дыхания мыши замедлится. Подтвердите адекватную седацию щипцом ноги.

Нанесите ветеринарную смазывающую офтальмологическую мазь на оба глаза мыши и поместите нос мыши в носовой конус, подавая смесь кислорода с содержанием фтора ISO 2,5% со скоростью от одного до двух литров в минуту. Далее настройте стерильное поле под мышкой. Затем простерилизуйте кожу головы с помощью 2,5% повидон-йода, а затем 70% раствора этанола.

Повторите стерилизацию еще два раза. Загрузите стопорный шприц на один миллилитр с одним миллилитром жира, который был уравновешен до комнатной температуры. Подсоедините канюлю для пересадки жира 14 калибра длиной восемь сантиметров к концу шприца.

Подготовьте систему, нажимая на поршень шприца до тех пор, пока в шприце не останется от 200 до 400 микролитров жира. Нажимая на поршень шприца, убедитесь, что канюля полностью заполнена жиром, наблюдая за выходом жира из дистального отверстия канюли с помощью тонких щипцов. Поднимите спинную кожу по средней линии, проходящей над самой большой стороной черепа.

Сделайте надрез на коже толщиной 1,5 миллиметра с помощью тонких ножниц. Наложите шестислойный нейлоновый шов через середину разреза, который позже будет использован для сближения краев раны. После того, как будет выполнена пересадка, не стоит перевязывать шов.

Затем создайте подкожный карман над черепом, вставив канюлю через разрез кожи и проведя канюлю вперед и назад веером по черепу, чтобы освободить любые соединительнотканные прикрепления к вышележащей коже после создания кармана, расположите канюлю по средней линии мыши прямо над черепом до тех пор, пока кончик не ляжет на терамосную сторону кармана. который должен находиться сразу за линией, проведенной между глазами. Медленно вводите жир в ретроградном режиме, продвигая поршень и оттягивая канюлю назад. С помощью щипцов сведите края раны вместе и поднимите их, чтобы жир не вытекал из кармана.

Завяжите шов, который был ранее наложен, следя за тем, чтобы первый узел слегка прилегал к коже. Завяжите еще три квадратных узла и разрежьте шов с трехмиллиметровым хвостиком. Извлеките мышь из наркоза и приступайте к восстановлению, как описано в текстовом протоколе.

Перед выполнением первого сканирования откалибруйте микрокомпьютерную томографию с помощью фантома визуализации, который различает интенсивность воздуха, воды и костей. После калибровки. Поместите четырех мышей в сканер в вентральном положении, две мыши сверху и две снизу.

Положите на стол для сканирования. Ранее он был сконструирован из 60-миллилитровых шприцев для удержания тела мыши и 10-миллилитровых шприцев в качестве носовых конусов. Подтвердите с помощью изображения скаута, что будет изображен весь череп мыши от носа до первого шейного позвонка и от верхней части черепа до основания черепа.

Продолжайте сканирование, как указано в текстовом протоколе. Откройте восстановленные изображения с помощью программного обеспечения для анализа микрокомпьютерной томографии, которое позволяет создавать области интереса или ROI путем выбора вокселей с использованием пороговых значений интенсивности пикселей. Начните с загрузки восстановленных изображений компьютерной томографии в двухмерном — корональном, аксиальном и сагиттальном видах.

Используя осевой срез в качестве ориентира, перейдите к сагиттальному срезу, который соответствует крайнему левому аспекту жирового трансплантата. Выберите верхний и нижний пороги интенсивности пикселей, которые захватывают все вокселы, соответствующие жировому трансплантатуту, но исключают окружающие ткани и кость. Определите ROI в сагиттальном виде, который соответствует жировому трансплантату

Используя ранее определенные пороги интенсивности пикселей, повторяйте эту процедуру каждый пятый сагиттальный срез, перемещаясь до тех пор, пока не будет достигнут крайний правый аспект трансплантата. Затем интерполируйте выбранные воксели из всех 2D ROI в одну объединенную 3D запись ROI, объем ROI, рассчитанный программным обеспечением. Визуализируйте 3D-изоповерхность для визуализации окончательного объема жирового трансплантата.

При последующем анализе убедитесь, что максимальные и минимальные пороговые значения интенсивности пикселей остаются такими же, как и при базовом анализе после сканирования мышей в течение восьмой недели. Усыпьте мышей, как описано в текстовом протоколе. Поместите мышь в операционное поле с помощью тенотомических ножниц, осторожно откройте карман и вышележащие участки кожи и соединительной ткани от жирового трансплантата.

На этом этапе может помочь иссечение участка вышележащей спинной кожи, чтобы помочь извлечению трансплантата. При иссечении оставайтесь как можно ближе к трансплантату, чтобы свести к минимуму соединительную ткань, взятую из трансплантата после иссечения трансплантата. Измерьте массу на разорванных весах с точностью не менее 0,01 грамма.

Жировые трансплантаты постепенно уменьшались в объеме в течение исследования, что привело к 62,2% средней выживаемости к восьмой неделе. По завершении сканирования на восьмой неделе каждый жировой трансплантат был извлечен по одному куску. Для сравнения разницы между объемными измерениями жирового трансплантата, полученными с помощью микрокомпьютерной томографии или рассчитанными на основе физической массы, был использован тест WIL на основе ранговой суммы коксина.

Существенной разницы между этими двумя методами не обнаружено. После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа за сеанс при правильном выполнении. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о том, что операции и реконструкции должны выполняться одинаково каждый раз после этой процедуры.

Другие методы, такие как иммуноокрашивание и Q-R-T-P-C-R, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как различные методы трансплантации влияют на васкуляризацию и экспрессию генов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как обрабатывать липоаспират для серийной компьютерной томографии трансплантатов in vivo, оценить приживаемость трансплантата и спланировать трансплантаты для гистологии веса, а также дальнейший анализ после его разработки. Этот метод проложил путь исследователям в области пластической хирургии к изучению пересадки жира в модели зеркального отражения.