В режиме реального времени электрофизиологии: Использование замкнутой протоколы к Probe нейронов динамики и Beyond

Общая цель данного эксперимента заключается в проведении in vitro динамического зажима в кортикальных нейронах с использованием общедоступного программного инструментария LCG. Это достигается путем подготовки срезов соматосенсорной коры крысы для проведения патч-кламп регистраций из парамедиальных клеток. На втором этапе к регистрируемой клетке применяется серия автоматизированных электрофизиологических протоколов, что обеспечивает стандартную характеристику клетки, которая будет полезна для последующего анализа и сравнения различных типов клеток.

Затем моделируется инъекция возбуждающих и тормозных синаптических событий. Чтобы воссоздать состояние высокой проводимости, характерное для неокортикальных нейронов in vivo, результаты демонстрируют, как фоновая синаптическая инъекция модулирует усиление кортикальных клеток. Основным преимуществом данного метода перед существующими подходами является возможность встраивания экспериментальных записей в более сложные рабочие процессы, используя, например, результат одного экспериментального протокола в качестве входных данных для другого протокола.

Этот метод может помочь стандартизировать электрофизиологические протоколы, ускорить анализ данных и создать основу для обмена данными между лабораториями. Хотя изначально этот метод был разработан для проведения записей в режиме wholesale patch CLA in vitro, его также можно удобно использовать для других экспериментальных препаратов и протоколов, таких как записи в режиме in vivo patch, CLA или записи с помощью микроэлектродных матриц. После извлечения мозга крысы удалите мозжечок и разделите два полушария по срединной линии с помощью скальпеля, удалите излишки жидкости из одного из полушарий и приклейте его к наклонной платформе каплей суперклея.

Затем быстро добавьте несколько капель CSF на поверхность мозга и перенесите его в камеру Vibram. С помощью лезвия удалите первые 2,5–3 мм ткани мозга. После этого отрегулируйте скорость и частоту срезания, чтобы минимизировать повреждение поверхности срезов.

Затем установите толщину срезов 300 µm и начните нарезку. Когда лезвие пройдет через кору, используйте лезвие бритвы или изогнутую иглу, чтобы сделать надрезы над гиппокампом и по краям интересующей области коры. После этого перенесите срезы в многолуночную инкубационную камеру при температуре 36 °C.

В данной процедуре поместите срез в регистрирующую камеру, используя объектив с 40-кратным увеличением. Найдите здоровые клетки в пятом слое на глубине от 600 до 1000 мкм под поверхностью мозга; такие клетки обычно имеют более низкий контраст, гладкую форму и не являются отечными.

После обнаружения здоровой клетки заполните микропипетку внутриклеточным раствором на одну треть. Затем установите её в головку микроманипулятора в предварительно настроенной операционной системе Linux. Запустите команду.

Дождитесь появления приглашения командной строки Shell. Введите эту команду, чтобы убедиться, что плата сбора данных не управляет усилителем. Затем создайте избыточное давление от 30 до 50 millibars, нажав на поршень шприца, подключенного к держателю пипетки.

Затем расположите пипетку примерно на 100 µm над срезом и переместите ее к целевой клетке, используя режим приближения микроманипулятора. После этого настройте смещение пипетки на электрофизиологическом усилителе и подайте тестовый импульс 10 mV в режиме фиксации потенциала. Используя команду LCG SEAL для мониторинга сопротивления пипетки, снизьте давление до 10–30 mbar, осторожно оттянув поршень шприца назад.

Осторожно подведите пипетку к клетке и, наблюдая за изображением на мониторе видеокамеры, проверьте образование углубления. Одновременно с этим следите за увеличением сопротивления, вызванного тестовым импульсом, наблюдая за формой кривой тока на мониторе. При увеличении сопротивления пипетки и образовании углубления на клетке немедленно сбросьте давление и приложите к пипетке осторожное отрицательное давление, чтобы способствовать формированию плотного контакта (seal).

Тем временем постепенно снижайте удерживающий потенциал до -70 мВ. Осторожно примените вакуум, чтобы разорвать мембрану клетки и установить конфигурацию whole-cell. Затем охарактеризуйте клетку с точки зрения ее электрических свойств.

С использованием кода команды LCGE. Здесь представлен средний потенциал действия патч-кламп нейрона пятого слоя параметаллической области с порогом -50.5 mV. На данном рисунке показано измерение пассивных ответов на гиперполяризующие токи.

Определение основных активных свойств клетки показывает, что клетка представляет собой нейрон с регулярной активностью спайков и минимальной адаптацией к введению имитированных возбуждающих постсинаптических потенциалов; перейдите в каталог, где будет сохранен следующий эксперимент, введя эту команду в командной строке оболочки. Вместо использования традиционных аппаратных органов управления усилителя, для проведения балансировки моста и компенсации емкости оцените ядро электрода, необходимое для выполнения активной компенсации электрода, выполнив эту команду.

Полное ядро представляет собой сумму двух компонентов: быстрого электродного ядра и более медленного мембранного ядра, которое обуславливает экспоненциальный хвост, наблюдаемый в полном ядре. Первое представляет собой непараметрическую модель пипетки. При инъекции тока для разделения мембранного и электродного ядер команда LCG kernel предложит пользователю указать количество точек, составляющих быстрое электродное ядро. Затем выберите число таким образом, чтобы электродное ядро охватывало конец хвоста экспоненциального затухания.

Затем проведите эксперимент с динамическим зажимом (dynamic clamp), используя эту команду. В завершение визуализируйте результаты. Ниже представлено воспроизведение активности, имитирующей условия in vivo, с помощью динамического зажима.

Красные и синие кривые представляют собой моделирование возбуждающих и тормозных синапсов соответственно. Здесь представлены записи изменения напряжения, зарегистрированные от нейрона L5 параметальной области, который подвергался бомбардировке возбуждающими или тормозными постсинаптическими токами. Соответствующие возбуждающий, тормозный и общий токи, вводимые в клетку, показаны на графике.

Растровый график спайков, зарегистрированных в течение 20 попыток, показывает, что нейрон может отвечать крайне надежно и точно на один и тот же входной сигнал. После просмотра этого видео у вас должно появиться четкое представление о том, как проводить эксперименты с динамическим освещением с помощью бесплатного программного инструментария LCG. Данная процедура может быть расширена на другие протоколы с замкнутым контуром для исследования широкого круга вопросов, от возбудимости нейронов до сложных сетевых взаимодействий.