В режиме реального времени электрофизиологии: Использование замкнутой протоколы к Probe нейронов динамики и Beyond

Общая цель данного эксперимента заключается в выполнении динамического зажима in vitro в корковых нейронах с использованием свободно доступного программного инструментария LCG. Это достигается путем подготовки срезов соматосенсорной коры крысы для записи с помощью патч-клэмпа из параметаллических клеток. В качестве второго шага к регистрируемой клетке применяется серия автоматизированных электрофизиологических протоколов, которые обеспечивают стандартную характеристику клетки, которая будет полезна для последующего анализа и сравнения между типами клеток.

Далее моделируется инъекция возбуждающих и тормозящих синаптических событий. Чтобы воссоздать состояние высокой проводимости, испытываемое нейронами неокортекса in vivo, результаты показывают, как фоновая синаптическая инъекция модулирует прирост клеток коры. Основным преимуществом этой методики перед существующими методами является возможность встраивания экспериментальных записей в более сложные рабочие процессы за счет использования, например, результата одного экспериментального протокола в качестве входных данных для другого протокола.

Этот метод может помочь стандартизировать электрофизиологические протоколы, ускорить анализ данных и проложить путь к обмену данными между лабораториями. Хотя этот метод изначально был разработан для оптовой записи патчей CLA in vitro, его также можно удобно использовать для других экспериментальных приготовлений и протоколов, таких как патч in vivo, записи CLA или ускоренные записи с микромассивами гонки. После извлечения мозга крысы отбрасывают мозжечок и разделяют два полушария по средней линии с помощью скальпеля, удаляют лишнюю жидкость из одного из полушарий и приклеивают его на наклонную платформу с помощью капли суперклея.

Затем быстро нанесите несколько капель ликвора на мозг и перенесите его в камеру Вибрама. Удалите первые 2,5-три миллиметра мозговой ткани с помощью лезвия. После этого отрегулируйте скорость и частоту нарезки, чтобы ограничить повреждение поверхности среза.

Далее устанавливаем толщину 300 микрометров и начинаем нарезку. После того, как лезвие пройдет мимо коры головного мозга, используйте лезвие бритвы или изогнутую иглу, чтобы сделать надрез над гиппокампом и по краям интересующей области коры. После этого переложите срезы в многолуночную инкубационную камеру при температуре 36 градусов Цельсия.

Во время этой процедуры поместите срез в камеру записи с линзой с 40-кратным увеличением. Ищите здоровые клетки в слое 5 и от 600 до 1000 микрометров. Ниже поверхности мозга эти клетки обычно имеют более низкий контраст, гладкий вид и не опухшие.

Как только здоровая клетка будет найдена, загрузите одну треть микропипетки внутриклеточным раствором. Затем поместите его в головную сцену в предварительно настроенной операционной системе Linux. Запустите команду.

Оболочка добавляет свою подсказку. Введите эту команду, чтобы убедиться, что плата сбора данных не управляет усилителем. Затем приложите от 30 до 50 миллибар положительного давления, нажав на поршень шприца, который подключен к держателю пипетки.

Далее поместите пипетку примерно на 100 микрометров выше среза и переместите пипетку к целевой ячейке, используя режим приближения микромного манипулятора. После этого отрегулируйте смещение пипетки на усилителе электрофизиологии и выведите тестовый импульс напряжением 10 милливольт в режиме зажима напряжения. С помощью команды LCG SEAL проверьте сопротивление пипетки, затем снизьте давление до 10-30 миллибар, вытащив поршень шприца.

Аккуратно подойдите к клетке и проверьте на образование ямочки, наблюдая за изображением на мониторе видеокамеры. В то же время отслеживайте увеличение сопротивления, вызванное тестовым импульсом, наблюдая за текущей формой сигнала, отображаемой на мониторе. Когда происходит увеличение сопротивления пипетки и образование углубления на ячейке, немедленно сбросьте давление и слегка надавите на пипетку, чтобы помочь образованию уплотнения.

Тем временем постепенно снижайте удерживающий потенциал до минус 70 милливольт. Примените мягкое отсасывание, чтобы разорвать клеточную мембрану и создать всю конфигурацию клетки. Затем охарактеризуйте ячейку с точки зрения ее электрических свойств.

С помощью команды LCGE code. Вот средний потенциал действия параметаллического нейрона пятого слоя с порогом отрицательных 50,5 милливольт. На этом рисунке показано измерение пассивных откликов на гиперполяризационные токи.

Идентификация основных активных свойств клетки показывает, что клетка представляет собой обычный спайковый нейрон, и существует минимальная адаптация к введению смоделированных возбуждающих, постсинаптических потенциалов изменения в директорию, где будет сохранен следующий эксперимент путем ввода этой команды в командной строке оболочки. Вместо того, чтобы воздействовать на обычное аппаратное управление усилителем. Чтобы применить балансировку моста и компенсацию емкости, оцените ядро электрода, необходимое для выполнения компенсации активного электрода, выполнив эту команду.

Полное ядро представляет собой сумму двух компонентов: ядра с быстрым электродом и более медленного мембранного ядра, которое дает начало экспоненциальному хвосту, наблюдаемому в полном ядре. Первая представляет собой непараметрическую модель пипетки При вводе тока в разделительные ядра мембраны и электрода команда ядра LCG запросит у пользователя количество точек, составляющих ядро быстрого электрода. Затем выберите число так, чтобы ядро электрода закрывало конец хвоста экспоненциального распада.

Затем проведите эксперимент с динамическим зажимом с помощью этой команды. Наконец, визуализируйте результаты. Здесь воссоздана активность in vivo с использованием динамического зажима.

Красные и синие следы представляют собой симуляцию возбуждающих и тормозных синапсов соответственно. А вот следы напряжения, записанные от параметаллического нейрона типа L-5, который был подвергнут бомбардировке возбуждающими или тормозящими постсинаптическими токами. Соответствующие возбуждающие, тормозные и суммарные токи, вводимые в ячейку, показаны на диаграмме.

Растровый график спайков, полученных в ходе 20 испытаний, показывает, что нейрон может быть чрезвычайно надежным и точным в ответ на один и тот же вход. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить эксперименты с динамическими лампами с использованием свободно доступного программного инструментария. ЛКГ. Эта процедура может быть распространена на другие протоколы замкнутого цикла для исследования широкого спектра вопросов, начиная от нейронной возбудимости и заканчивая сложными сетевыми взаимодействиями.