In Vitro Ферментативный анализ для измерения транскрипции ингибирование галлия (III) и H 3 5,10,15-трис (пентафторфенил) corroles

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить, ингибируют ли потенциальные противораковые соединения реберную нуклеиновую кислоту или транскрипцию РНК. Это достигается путем предварительной подготовки реакций транскрипции РНК, включая потенциальные ингибиторы В этом эксперименте исследуются соединения СНО, которые проявляют дифференциальные цитотоксические свойства, на предмет ингибирования транскрипции РНК и сравниваются с известными ингибиторами. После тщательного перемешивания реакционных пробирок инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия и удаляют аликвоты в желаемые моменты времени.

Затем гель-электрофорез используется для оценки относительного ингибирования, поскольку бромид иридия флуоресцирует при связывании РНК, более темные полосы в геле соответствуют более высоким концентрациям РНК. Чтобы количественно оценить степень ингибирования транскрипции, проводят ультрафиолетовую, видимую или ультрафиолетовую спектроскопию в сравнении с ней. В конечном счете, это видео демонстрирует простой метод оценки противораковых свойств.

Путем оценки ингибирования транскрипции кораллами, потенциальные противораковые препараты должны быть оценены на предмет их способности ингибировать РНК. Транскрипция. Раковые клетки человека часто становятся зависимыми от одного активированного онкогена для лечения выживания. Блокирование экспрессии онкогенов эффективно устраняет раковые клетки.

Описанная здесь процедура ингибирования транскрипции РНК является полезным способом выявления потенциальных кандидатов на противораковые препараты и получения дополнительной информации об их механизме действия. Для начала готовят Кэрол и ингибиторные соединения в соотношении комплекса к ДНК 0,01 к одному моляру. Для этого растворяют cin d Tripoli, TPFC и галлий TPFC и оксид диметилсульфа в чистых отдельных емкостях.

Окончательную концентрацию получают с помощью разведения злаков с водой, свободной от нуклеазы, до начала реакции транскрипции. Приготовьте необходимые реактивы самостоятельно или приобретите их у коммерческого поставщика. Разморозьте все застывшие реактивы на льду.

Затем соедините реагенты для реакции транскрипции при комнатной температуре, как описано в текстовом протоколе. Тщательно перемешайте, переворачивая пробирку или осторожно передавая смесь с помощью пипетки вверх и вниз, прежде чем инкубировать реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия. Затем удалите четыре микролитра аликвоты из каждой реакции через каждый час и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия, изменяя по мере необходимости для желаемых временных точек после реакции транскрипции.

Очистите РНК от других компонентов реакции с помощью спиновых колонок РНК, как описано в текстовом протоколе, для выполнения агрогельного электрофореза приготовьте трисацетат ЭДТА или ТАЭ бегущий буфер и 1000 стоковых растворов бромида эфирия. И, как описано в текстовом протоколе, всегда надевайте соответствующие средства защиты при работе с бромидом эфирия, так как он токсичен. Далее приготовьте гель 1%aros, растворив 10 граммов ультрачистого агроса в одном литре одного буфера XTAE и растопив агрос в обычной микроволновой печи.

Как только он остынет до 50 градусов по Цельсию, добавьте один миллилитр 1000 x бромида иридии в 1%-ный раствор агроса и перемешайте, аккуратно взбалтывая или переворачивая в закрытой емкости. Затем вылейте агрораствор в платформу для литья геля и дайте гелю застыть при комнатной температуре после того, как гель застынет. Извлеките клинья из резервуара для электрофореза и добавьте достаточное количество буфера TAE, чтобы покрыть гель до тех пор, пока лунки не будут погружены в воду.

Перед снятием гелевого гребня убедитесь, что уровень буфера TAE находится примерно на один миллиметр выше уровня геля. Чтобы подготовить образцы РНК к гель-электрофорезу, смешайте один микролитр каждого очищенного образца аликвоты с одним микролитром буфера для загрузки геля, тщательно перемешайте пипетированием вверх и вниз с помощью микропипетки. Следите за тем, чтобы не оставить пузырьков воздуха и не перемешать образцы между лунками.

Прикрепите проводники так, чтобы ДНК мигрировала в гель к положительному отведению. Установите напряжение на нужный уровень. Обычно от одного до 10 вольт на сантиметр геля.

Гель размером 23 на 25 сантиметров при напряжении 250 вольт будет работать примерно один час. Гель размером восемь на восемь сантиметров при напряжении 150 вольт будет работать примерно 20 минут. Меньшие фрагменты РНК работают с лучшим разрешением при более высоких напряжениях.

Запускайте гель в течение любого времени, достаточного для значительного разделения между потенциальными фрагментами РНК с использованием миграции красителей для контроля прогресса разделения. Выключите источник питания до того, как краситель из буфера загрузки переместится в конец изображения геля. РНК под воздействием ультрафиолетового излучения в виде бромида атерия флуоресцирует, делает снимок изображения и сравнивает интенсивность флуоресценции очищенной РНК в каждом состоянии.

Чтобы выполнить количественное определение РНК с помощью УФ-спектроскопии, поместите два микролитра воды на NanoDrop 2000 или аналогичную машину и измерьте заготовку. Затем поместите два микролитра каждого образца РНК после очистки на спектрофотометр и измерьте ультрафиолетовый видимый свет в диапазоне длин волн от 200 нанометров до 800 нанометров в случае, если поглощение превышает оптическую плотность единицы. Разбавьте образцы в воде, свободной от нуклеаз, чтобы получить оптическую плотность меньше единицы.

Наконец, используйте программное обеспечение для построения графиков для построения различных образцов и сравнения оптической плотности на 260 нанометрах, а для получения изображения транскрибируемой РНК используется гель-электрофорез. Если комплекс ингибирует транскрипцию РНК, выработка РНК снижается, и тебан будет казаться более легким. Актин d и триптолин демонстрируют явное снижение РНК по сравнению с контролем, как и ожидалось от этих давно изученных ингибиторов.

Галлиевая полоса TPFC также имеет очень низкий уровень РНК, в то время как полоса TPFC практически не проявляет ингибирования и демонстрирует ту же относительную интенсивность, что и контрольная УФ-лампа. После прохождения транскрипции РНК в течение четырех часов и очистки с помощью спин-колоночной хроматографии РНК здесь представлены спектры длин волн от 220 нанометров до 350 нанометров.

Три из четырех реакций транскрипции, обработанных ингибиторами, дали меньше РНК, чем контрольная ДНК, обработанная галлием TPFC, транскрибируя только одну 14-ю часть РНК, чем необработанная ДНК, ОБРАБОТАННАЯ D-N-A-T-P-F-C, не показала явного ингибирования. Таким образом, цитотоксичность в клеточных линиях, обработанных TPFC, не связана с ингибированием транскрипции РНК. Все образцы имеют коэффициент поглощения 260 на 280 нанометров примерно 2,2, что указывает на относительно чистые образцы.

Следуя этой процедуре, можно проверить другие переменные в реакции, такие как концентрация и порядок присоединения, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как механизм действия. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как определить, ингибирует ли ваше противораковое соединение транскрипцию РНК. Не забывайте, что бромид может быть чрезвычайно опасен для вашего здоровья.

Всегда надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты и никогда не используйте микроволновые растворы или агропродукты, содержащие бромид Афины.