Оценка эффективности снадобья рака сенсибилизации

Общая цель данного эксперимента заключается в оценке эффективности сенсибилизации к противоопухолевым препаратам путем измерения изменений клеточного метаболизма in vitro и частоты метастазов in vivo. Это достигается путем предварительного пересечения раковых клеток in vitro антисмысловыми молекулами, чтобы сбить с ног интересующую цель. Затем трансфицированные клетки помещаются на биосенсорные чипы и загружаются в систему измерения метаболизма для перечисления изменений в подкислении, дыхании и адгезии во время лечения препаратами.

Отдельно трансфицированные клетки обрабатываются препаратом и вводятся в венозный кровоток куриного эмбриона с целью оценки влияния на частоту метастазирования. Результаты показывают сенсибилизацию к противораковым препаратам, что иллюстрируется изменениями в клеточном метаболизме и частоте метастазирования. Этот метод расширяет возможности развития терапии рака, поскольку позволяет одновременно оценивать параметры, которые не всегда учитываются во время обычных доклинических испытаний мишеней или соединений для лекарств.

Хотя этот метод может дать представление о новых мишенях для лекарств, участвующих в репарации ДНК, он также может быть применен для валидации мишеней в других системах, таких как контроль клеточного цикла. После пересечения опухолевых клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, согласно текстовому протоколу в стерильной среде, используйте 400 микролитров PBS для тщательной промывки шести биосенсорных чипов Чтобы стерилизовать чипы, удалите PBS и добавьте 400 микролитров 70% этанола Инкубируйте в течение 20 минут, прежде чем использовать PBS для промывки чипов три раза. Поместите по три чипса в стерильные чашки для культур с маркировкой контрольной и интересующей цели и пометьте две 50-миллилитровые тубы таким же образом.

Затем используйте PBS для промывания трансфицированных клеток перед добавлением соответствующего объема 0,25% трипсина ЭДТА, подождите, пока монослой отделится, и перенесите клеточную суспензию в соответствующую пробирку. После подсчета клеток отрегулируйте объем, чтобы достичь конечной концентрации 6,0 умножить на 10 до пятой клетки на миллилитр, добавив среду или концентрируя клетки. Готовя по одной группе, добавьте по 250 микролитров клеточного раствора в каждый чип биосенсора.

Поместите стерильные чашки с чипсами в камеру с влажностью, чтобы предотвратить испарение, и инкубируйте в течение ночи для проведения измерений метаболизма в соответствии с экспериментальным планом, подробно описанным в текстовом протоколе на этикетке на 1450 миллилитровых пробирках, и добавьте 50 миллилитров роста, среду плюс 0,2% FBS и по одному пенициллину и стрептомицину. Или ПС. Поместите шесть пробирок в одну систему измерения метаболизма, штатив для пробирок — шесть в другую, а оставшуюся пробирку — в третью штатибу, которая также содержит пробирки с цисплатином. Используйте воздухопроницаемую мембрану для герметизации первых двух стоек, чтобы предотвратить испарение.

Далее приготовьте соответствующий объем из шести микромолярных цисплатинов в среде с 0,2% FBS и одним XPS. Распределите необходимый объем среды по четырем помеченным 50-миллилитровым пробиркам и поместите их обратно в четыре слота третьего штатива для измерения метаболизма. Используйте воздухопроницаемую мембрану для герметизации трубок.

Нанесите маркировку на шесть пробирок по 50 мл и добавьте по 20 мл в каждую 0,1%-ный раствор Triton X В среде раствора Triton X будут лежать все оставшиеся элементы и будет предоставлено нулевое значение для каждого чипа. Поместите пробирки в четвертую решетку для пробирок и запечатайте их. Затем загрузите чипы в биомодули.

Загрузите два кронштейна в держатель двух тормозов, а затем начните эксперимент. После подготовки куриных эмбрионов, как указано в текстовом протоколе, на второй день трансфекции клеток разделите контрольную и целевую группы на две колбы для носителя и две для цисплатина. Аспирируйте среду и используйте три миллилитра свежей, средней или средней с шестью микромолярными цисплатинами для восполнения.

Колбы инкубируются в течение шести часов. После инкубации аспирируйте среду, затем промывайте и пробуйте анизировать клетки, переложите клеточную суспензию в четыре надлежащим образом помеченные 15-миллилитровые пробирки перед вращением и с помощью PBS трижды промыть ресуспендию клеток. А затем, после подсчета, используйте PBS для разбавления или центрифугирования для концентрации клеток до конечной концентрации 1,0 умножить на 10 до шестой клетки на миллилитр.

Переложите клеточную суспензию в пятимиллилитровые пробирки с маркировкой для инъекций и положите на лед. Далее отложите 24 9-дневных куриных эмбриона для инъекций под стереомикроскопом и с помощью стеклянной иглы, прикрепленной к гибкой трубке, соединенной с одномиллилитровым шприцем медленным пульсирующим движением. Ввести 1,0 раза по 10 до пятой клетки в объеме 100 мкл в венозный кровоток хоальтоической мембраны или кулачок с помощью мягкой салфетки.

Аккуратно промокните место инъекции, чтобы остановить поток крови и впитать любые пролитые спины. Надлежащим образом маркируйте каждый контейнер с эмбрионами после каждой инъекции под флуоресцентным микроскопом. Подтвердите наличие и распределение флуоресцентных клеток в сосудистой сети кулачка.

Обратите внимание на любые эмбрионы, у которых количество опухолевых клеток кажется низким или распределение плохое. Наконец, поместите куриные эмбрионы в камеру влажности и инкубируйте в течение семи-девяти дней перед перечислением метастатических очагов, как показано в текстовом протоколе, как показано здесь, через 24 часа у человека, A 5 49 клеток рака легких, обработанных BRCA 2, нацеленными на SO и цисплатин, наблюдалось раннее и необратимое снижение дыхания по сравнению с клетками, которые получали контрольный СО и только цисплатин. Снижение на 39% по сравнению с контрольными клетками началось примерно за 10 часов до обнаруживаемого снижения клеточной адгезии, что позволяет предположить, что оно произошло независимо от изменений в количестве клеток и что это может быть формирующим событием, предшествующим гибели клеток, как показано здесь.

В течение 72-часового эксперимента не наблюдалось никакой разницы в подкислении, что позволяет предположить, что лечение BRCA, 2 a SO и цисплатином практически не влияло на метаболизм глюкозы. В этом эксперименте клетки рака легкого A 5 49 человека обрабатывали контролем A SO или BRCA two A SO в присутствии или отсутствии цисплатина и вводили в венозный кровоток кулачка. Девять дней спустя клетки, обработанные BRCA two a SO и цисплатином, показали на 77% меньшую частоту метастатических очагов по сравнению с клетками, обработанными только контрольным a SO и цисплатином или BRCA two A SSO, что позволяет предположить, что лечение BRCA two a SO и цисплатином может снизить или предотвратить метастатическую нагрузку у пациентов с солидными опухолями.

После этой процедуры могут быть выполнены более традиционные методы, такие как пролиферация клеток, анализы и исследования ксенотрансплантатов in vivo с целью дальнейшего изучения вклада конкретной мишени в повышение чувствительности к лекарственным средствам.