Mesenteric лимфатический проток канюлированного крысиной модели: Приложение к оценке кишечных лимфатической транспорта лекарства

Общая цель данной процедуры заключается в оценке скорости и степени транспорта липидов и лекарственных средств в лимфатическую систему кишечника после их введения в кишечник. Для этого сначала проводят изоляцию и канюляцию брыжеечного лимфатического протока для сбора лимфы. На втором этапе выполняется канюляция двенадцатиперстной кишки для обеспечения инфузии в кишечник, после чего проводится канюляция сонной артерии для возможности забора проб крови.

На заключительном этапе экспериментальный препарат вводится в двенадцатиперстную кишку, после чего собирают лимфу и кровь для количественного определения системных уровней липидов или лекарственного вещества. В конечном итоге данная модель может быть использована для оценки общего всасывания и кишечного лимфатического транспорта липидов и лекарств после их введения в кишечник. Основным преимуществом этого метода является возможность прямого канюлирования брыжеечного лимфатического протока и сбора лимфы на протяжении всего периода эксперимента.

Это позволяет оценить абсолютную массу материала, который поступает в брыжеечный лимфатический проток и проходит через него. Данная модель обеспечивает возможность оценки транспорта лекарственных средств и липидов in vivo. Она также может быть использована для измерения кишечного лимфатического транспорта любого интересующего фактора, а также для анализа изменений в лимфатическом транспорте таких факторов в ответ на различные воздействия или при различных патологических состояниях.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку канюлирование брыжеечного лимфатического протока является сложной и трудоемкой процедурой из-за того, что проток мал, хрупок, особенно у голодающих животных. Процедуру продемонстрируют моя коллега и преподаватель Университета Монаша доктор Натали Кас и старший постдок группы доктор Л. Дж. Хью. За день до операции обрежьте канюли до нужной длины и с помощью стерильного хирургического лезвия сделайте скос на конце каждого отрезка трубки. Затем, чтобы подготовить интрадуоденальную канюлю, согните канюлю петлей и нагрейте ее, чтобы создать точку закрепления в трубке.

В день операции выбрейте шерсть с правой стороны брюшной полости, шеи и в области левой ключицы анестезированной взрослой крысы, затем асептически очистите операционные поля, трижды последовательно обработав их раствором повидон-йода и 70% этанолом для канюляции лимфатического протока. Положите животное на левый бок (правой стороной вверх) и с помощью стерильного скальпеля сделайте прямой разрез верхнего слоя мышц брюшной стенки длиной 4 см от мечевидного отростка к правому боку, примерно на 2 см ниже реберного края. Отодвиньте тонкий кишечник под левую брюшную стенку и зафиксируйте его в этом положении с помощью двух-трех кусочков стерильной марли, пропитанных физиологическим раствором.

Затем зафиксируйте крысу над пластиковым шприцем объемом 10 мл, расположенным горизонтально под спиной животного на уровне правой почки. Чтобы облегчить визуализацию брыжеечного лимфатического протока, найдите верхний брыжеечный лимфатический проток диаметром примерно от 0,5 до 1 мм, который расположен перпендикулярно правой почке, непосредственно ростральнее и параллельно темно-красной пульсирующей брыжеечной артерии. Обратите внимание, что у крыс, которые не подвергались голоданию (как показано здесь), верхний брыжеечный лимфатический проток белый, непрозрачный и визуализируется легче, чем у инфицированных крыс.

Затем проведите пару прямых пинцетов через жировую клетчатку промежности у нижнего края правой почки параллельно верхнему брыжеечному лимфатическому протоку и через слои соединительной ткани непосредственно под полой веной. После этого, используя кончик пинцета, протяните лимфатическую канюлю через жировую клетчатку промежности так, чтобы один ее конец находился непосредственно рядом с брыжеечным лимфатическим протоком, а другой был выведен за пределы тела животного на уровне правой почки. Затем с помощью хирургического микроскопа и ювелирного пинцета изолируйте брыжеечный лимфатический проток, отделяя его от вышележащих слоев соединительной и жировой ткани путем тупой диссекции, начиная с нижнего конца и стараясь не повредить лимфатический проток в процессе его изоляции.

С помощью кончика тонкого пинцета сделайте небольшое отверстие в лимфатическом протоке. Убедившись, что лимфатическая канюля полностью заполнена антикоагуляционным раствором и в ней нет пузырьков воздуха, с помощью маленького пинцета введите канюлю примерно на два-четыре миллиметра внутрь брыжеечного лимфатического протока через место прокола. При успешном канюлировании из свободного собирающего конца канюли будет наблюдаться постепенный отток кишечной лимфы.

В этом случае нанесите маленькую каплю цианоакрилатного клея на отверстие входа в лимфатический проток, чтобы зафиксировать канюлю, стараясь не перекрыть сосуд избытком клея. Чтобы канюлировать двенадцатиперстную кишку, сначала найдите соответствующий участок ткани — ярко-розовую часть тонкого кишечника, которая при осторожном потягивании вниз открывает желудок. Затем с помощью стерильной иглы 23-го калибра сделайте небольшой прокол в двенадцатиперстной кишке в области привратника, примерно на два сантиметра ниже места соединения желудка и двенадцатиперстной кишки.

Затем введите изогнутый J-образный конец дуоденальной канюли через прокол и зафиксируйте ее каплей акрилатного клея Sano. После этого зашейте разрез мышц брюшной стенки. Канюляцию сонной артерии можно выполнить до или после канюляции брыжечного лимфатического протока. Обычно мы предпочитаем канюлировать сонную артерию перед канюляцией лимфатического протока, чтобы снизить вероятность смещения лимфатической канюли при перемещении животного. Чтобы канюлировать сонную артерию, сначала сделайте отметку на канюле сонной артерии в 2.5 сантиметров от скошенного кончика, чтобы определить часть трубки, которую необходимо ввести в артерию.

Затем соедините нескрепленный конец канюли с иглой калибра 25G, присоединенной к шприцу с раствором антикоагулянта, и заполните канюлю раствором, убедившись в отсутствии пузырьков воздуха. Далее сделайте продольный разрез кожи длиной от 1 до 1,5 см в сагиттальной плоскости слева от трахеи, после чего с помощью тупоконечного пинцета препарируйте подкожную соединительную ткань, чтобы обнажить подлежащие парные мышцы шеи. Отодвиньте мышцы шеи, чтобы открыть пульсирующую левую сонную артерию, расположенную примерно в одном сантиметре под поверхностью кожи.

Затем удалите вышележащую соединительную ткань с артерии путем тупой диссекции и с помощью тупых анатомических пинцетов изолируйте участок артерии длиной примерно один сантиметр. Далее с помощью пинцета с тонкими кончиками проведите две шелковые нити под сонной артерией, расположив их по краям изолированного участка артерии. После этого завяжите узел на нити, расположенной дальше всего от сердца и ключицы крысы, и поместите прямой пинцет с тонкими кончиками под сонную артерию, чтобы перекрыть кровоток через артерию.

Теперь с помощью ирисных ножниц с тонким кончиком сделайте небольшой разрез на верхней поверхности артерии примерно на одной трети расстояния вниз от верхнего края изолированного участка. С помощью изогнутого пинцета введите кончик канюли в артерию. После введения извлеките прямой тонкий пинцет, перекрывая кровоток, и с помощью двух пар пинцетов продвиньте канюлю на 2.5 сантиметров вглубь артерии.

Один зажим используется для удержания канюли внутри артерии, чтобы предотвратить обратный ток крови, а другой — для введения канюли. Затем используйте малый артериальный зажим, чтобы зафиксировать канюлю в артерии. Введите раствор антикоагулянта в канюлю, после чего аспирируйте небольшое количество крови, чтобы подтвердить проходимость трубки.

Затем промойте канюлю раствором антикоагулянта и запечатайте конец с помощью пламени зажигалки. В завершение зафиксируйте канюлю на месте с помощью швов и снимите зажим с артерии. Затем наложите третий шов вокруг артерии и канюли, укоротите длину швов вокруг артерии и зашейте рану на шее дополнительными швами. После периода восстановления введите интересующий препарат животному через канюлю двенадцатиперстной кишки.

Как показано на графике, после введения модельного липофильного препарата халал-фанена средняя скорость лимфотока у крыс с успешно установленным канюляторным доступом составляла от 0,4 до 1,3 мл в час. У некоторых животных скорость лимфотока была несколько ниже в течение первых одного-трех часов после канюляции, после чего она возрастала, что является общепринятым явлением при успешной канюляции лимфатических сосудов; у крыс с неудачно проведенной канюляцией этот эффект отсутствовал. Тем не менее, на протяжении всего периода сбора скорость потока оставалась существенно ниже, чем в успешных экспериментах.

Аналогичным образом, в этих репрезентативных экспериментах кумулятивный лимфатический транспорт триглицеридов и халал-RIN был существенно ниже у животных с неудачно установленным канюлированием. В то же время в группах с успешным канюлированием средний кумулятивный транспорт халала составил 15,1% от дозы, а кумулятивный транспорт триглицеридов — 61 milligrams в течение 10 часов. В данном репрезентативном эксперименте по транспорту липидов доля введенной радиоактивно меченной дозы экзогенных липидов, транспортированных с лимфой, составила 54% Эти значения не имели значимых отличий от ранее наблюдавшихся показателей.

Для аналогичного состава скорость транспорта как триглицеридов, так и лекарственных средств в лимфу достигает пика через некоторое время после введения липидов и препарата, а затем возвращается к исходному уровню. Это является типичным для экспериментов по кишечному лимфатическому транспорту липидов и лекарственных средств. Скорость транспорта препарата в лимфу в каждый из временных периодов повторяет картину транспорта триглицеридов, поскольку препарат транспортируется в лимфу аналогичным образом.

В связи с липопротеинами, богатыми триглицеридами. После освоения метода процедура канюляции может быть выполнена в течение 30 минут при отсутствии осложнений. После выполнения данной процедуры компоненты собранной лимфы могут быть выделены и использованы в дополнительных экспериментах, например, для реинфузии животным-реципиентам с целью прямой оценки их функции, метаболизма, клиренса или особенностей распределения. После просмотра этого видео вы должны хорошо освоить методы изоляции и канюляции брыжеечного лимфатического протока, сонной артерии и двенадцатиперстной кишки.

Используя эти методы, вы сможете оценить транспорт как лекарственных средств, так и липидов и других факторов из кишечника через брыжеечный лимфатический узел и в брыжеечную лимфу in vivo.