Колориметрический анализ, что меры частности Гранзим протеолитической активности: Гидролиз Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28 ноября 2014 г.
Мы описываем простой количественный колориметрический анализ, который конкретно измеряет протеолитическую активность Granzyme B (GzmB) человека, мыши или крысы. Этот протокол может быть легко адаптирован для определения протеазной активности других гранулярных сериновых протеаз путем гидролиза других синтетических пептидных субстратов с соответствующей последовательностью узнавания.
Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении протеолитической активности протеазы гранзима B. Это достигается путем предварительного приготовления лизата исследуемых клеток с последующим быстрым добавлением субстрата в образцы. Активность гранзима B затем измеряется с помощью колориметрической реакции. В конечном итоге высокоспецифическое расщепление alla alla as s benzo под действием гранзима B может быть оценено на основе его уникальной специфичности к остаткам aspart acid.
Основным преимуществом данной методики перед существующими методами, такими как определение экспрессии гранзима B с помощью ПЦР или вестерн-блоттинга, является то, что гидролиз бензила специфичен для гранзима B и также указывает на активность протеазы. Для подготовки клеточных лизатов сначала выделите первичные NK-клетки из суспензий отдельных клеток селезенок мышей дикого типа C57BL/6 или контрольных мышей с нокаутом гена гранзима B методом негативной селекции с использованием имеющихся в продаже наборов в соответствии с инструкциями производителя после активации клеток. Трижды промойте культуру в PBS на максимальной скорости в течение двух-трех секунд, а затем ресуспендируйте осадок, содержащий не менее 5 миллионов NK-клеток, в 100 µL лизирующего буфера NP-40 на льду в течение 20 минут.
Затем центрифугируйте лизат в микроцентрифуге в течение 10 минут при 15 000 G и перенесите супернатант в новую пробирку. После определения концентрации белка согласно соответствующему коммерчески доступному протоколу, храните образец при минимальной концентрации примерно 2 mg/mL при температуре -20 °C для последующего проведения анализа активности гранзима B. Затем разведите минимум 100 µg белка лизата на образец в свежеприготовленном HEPES-буфере до конечного объема 160 µL.
Затем с помощью многоканального дозатора внесите по 50 µL образца в каждую лунку 96-луночного винилового планшета с U-образным дном в трех повторностях. Оставив три контрольные лунки только с буфером, добавьте в каждую по 100 µL разведенного DTNB. Затем быстро добавьте по 50 µL свежеразведенного субстрата alala asks s benzoyl в каждую из лунок только с буфером, затем в отрицательные контроли и, в завершение, в ожидаемые положительные образцы.
Измерьте активность аазе путем гидролиза alala as benzyl в микропланшетном ридере при оптической плотности 405 нанометров, используя протокол кинетического анализа с 25 измерениями каждые 15 секунд. В завершение используйте программное обеспечение ридера для расчета максимальной скорости расщепления субстрата для каждой лунки, а затем перенесите необработанные данные в соответствующую программу для статистического анализа, используя мышей с нокаутом гена гранзима. Было обнаружено, что синтетический пептидный субстрат alala as benzyl специфически гидролизуется гранзимом B. Дальнейшее интенсивное расщепление синтетического субстрата может быть измерено в лизатах клеток первичных NK-клеток дикого типа, но не в NK-клетках животных с нокаутом гранзима B, используемых в качестве контроля.
В данном эксперименте протеолитическая активность гранзима A, обладающего трипсиноподобной субстратной специфичностью и присутствующего в лизатах обоих типов клеток, была равной, что было определено по гидролизу BLT-бензила; I-E-P-D-P-N-A использовался в качестве общего субстрата для тестирования активности гранзима B у разных видов. В этом репрезентативном эксперименте анализ тетрапептидных последовательностей показал, что гранзим B человека, но не мыши, может эффективно расщеплять последовательность после IEPD, которая соответствует распознаваемой последовательности в bid как человека, так и мыши. Напротив, снижение количества лизата лейкемических NK-клеток человека с 30 мкг до 10 мкг по-прежнему приводит к наличию достаточного количества гранзима B для гидролиза субстрата I-E-P-D-P-N-A.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выбрать подходящий субстрат и экспериментальные контроли для анализа in vitro красного фермента B человека и мыши.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен количественный колориметрический анализ для измерения протеолитической активности гранзима B (GzmB) в образцах тканей человека, мыши или крысы. Метод может быть адаптирован для других гранулярных сериновых протеаз путем использования различных синтетических пептидных субстратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Активность протеаз
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Гранзим B представляет собой сериновую протеазу, участвующую в иммунных ответах.
- Измерение ее активности имеет решающее значение для понимания ее роли в клеточно-опосредованной цитотоксичности.
- Существующие методы, такие как ПЦР или вестерн-блоттинг, не позволяют напрямую измерить активность протеазы.
- Данный анализ обеспечивает специфическое и прямое измерение активности GzmB.
Цель исследования
- Разработать простой анализ для количественного определения активности GzmB.
- Предложить метод, который может быть адаптирован для других протеаз.
- Усовершенствовать существующие методики, обеспечив специфичность определения активности GzmB.
Используемые методы
- Подготовка клеточных лизатов из первичных NK-клеток.
- Использование колориметрической реакции для измерения активности GzmB.
- Выделение NK-клеток из селезёнок мышей дикого типа и мышей с нокаутом гена гранзима B.
- Гидролиз субстрата для оценки протеазной активности.
Основные результаты
- Данный анализ позволяет успешно измерить активность GzmB посредством специфического расщепления субстрата.
- Метод демонстрирует высокую специфичность к GzmB по сравнению с другими методами.
- Результаты указывают на активность протеазы на основании гидролиза субстрата.
- Метод может быть адаптирован для других гранулярных сериновых протеаз.
Выводы
- Разработанный анализ является надежным инструментом для измерения активности GzmB.
- Он обладает преимуществами по сравнению с традиционными методами за счет прямой оценки функции протеазы.
- Данный подход может способствовать развитию исследований иммунных ответов и биологии протеаз.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Точное измерение протеолитической активности гранзима B имеет решающее значение для подтверждения функции цитотоксических лимфоцитов при разработке методов иммунотерапии. Этот колориметрический анализ обеспечивает прямой специфический показатель активности протеазы, что позволяет на уровне механизмов снизить риски, связанные с взаимодействием с мишенью и проапоптотическим потенциалом в доклинических моделях. Совместимость данного метода с различными видами обеспечивает трансляционную преемственность от исследований на грызунах к применению у людей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути апоптоза, зависящие от Granzyme B, в цитотоксических лимфоцитах.
- Практическая ценность: позволяет отличить активную протеазу от простого наличия экспрессии, что снижает количество ложноположительных результатов при валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: способствует функциональному подтверждению роли Granzyme B как механистического драйвера иммуноопосредованного клиренса опухоли.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Используется субстрат Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl, который гидролизуется исключительно гранзимом B в системах человека, мыши и крысы.
- Количественный выход: Измеряются начальные скорости гидролиза с помощью колориметрической реакции с использованием DTNB при 405 nm для кинетического анализа.
- Контроль специфичности: Исключается влияние каспаз и других гранзимов благодаря уникальному предпочтению к аспартату.
- Воспроизводимость: Совместимо с нефракционированными лизатами и рекомбинантными протеазами при условии включения надлежащих контролей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: Применимо к моделям иммунного надзора за опухолями, вирусным инфицированием и аутоиммунной патологией, при которых Granzyme B опосредует гибель клеток-мишеней.
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает согласованное измерение активности у разных видов, что способствует экстраполяции данных с мышей на человека.
- Решения с учетом рисков: Предоставляет биомаркер на основе активности для приоритизации кандидатов с подтвержденным цитотоксическим потенциалом.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, где функциональная активность протеазы позволяет судить о биологической эффективности и механизме действия.
- Открытия в биологии: подтверждает гипотезу о том, что гранзим B индуцирует апоптоз в эффекторных лимфоцитах посредством субстрат-специфического расщепления.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные количественные показатели активности для сравнения различных условий или генетических pertubation.
- Аналитика: позволяет получать кинетические данные (Vmax) для межобразцового сравнения и статистической оценки протеолитической способности.
- Трансляционные исследования: поддерживает доклиническую валидацию путем подтверждения консервативной активности гранзима B у человека, мыши и крысы.
- Повторное использование в масштабах предприятия: платформа может быть адаптирована для других гранулярных протеаз путем замены субстрата, что повышает ее долгосрочную полезность.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Прямое измерение протеолитической функции снижает зависимость от суррогатных маркеров, таких как уровни мРНК или белков.
- Операционная ценность: Простой формат на основе планшетов с минимальным временем непосредственного участия оператора и совместимостью со стандартными планшетными ридерами.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе функциональной активности, а не только экспрессии, что повышает прогностическую достоверность.
- Влияние на портфель: Способствует продвижению иммунотерапевтических препаратов с учетом рисков путем подтверждения механистической эффективности на ранних этапах разработки.
Особенности реализации
- Требуется опыт изоляции первичных иммунных клеток и лизиса в контролируемых условиях для сохранения активности протеаз.
- Необходим доступ к прибору для чтения микропланшетов с возможностью кинетического измерения OD405 и совместимому программному обеспечению для анализа.
- Для подтверждения специфичности анализа, как показано в источнике, необходимо включить контроли с нокаутом Granzyme B.
- Адаптация метода для других протеаз требует валидации альтернативных субстратов для поддержания эквивалентной специфичности и окна сигнала.
- Практическое ограничение: анализ измеряет общую активность лизата и может потребовать фракционирования для исследований субклеточной локализации.
