Функциональная Реорганизация и активности канала измерения очищенной дикого типа и мутантных CFTR белка

Общая цель данной процедуры заключается в измерении функции популяции каналов CFTR в реконструированной системе и изучении реакции каналов на присутствие молекул-модуляторов. Это достигается путем предварительной очистки белка CFTR дикого типа или мутантного белка из клеток SF nine с использованием метода экспресс-очистки, который позволяет получить функциональный белок CFTR в растворе детергента. Вторым этапом является реконструирование очищенного белка в протеолипосомы с определенным липидным составом, выбранным исследователем.

Затем путем удаления избыточного иодида из липосом создается химический градиент иодида через мембрану, что формирует движущую силу для перемещения ионов через канал CFTR. Заключительным этапом является активация канала и инициирование высвобождения иодида из протеолипосом в присутствии исследуемой молекулы-модулятора. В конечном итоге для мониторинга функции канала CFTR в этой реконструированной системе в режиме реального времени используется иодид-селективный электрод.

Данный метод позволяет изучать активность хлоридных каналов очищенной популяции молекул CFTR после их реконструирования в фосфолипидных липосомах. Хотя этот метод был разработан для получения данных о функционировании канала CFTR и эффекте модуляторов из числа малых молекул, он также может быть применен к другим системам, например, для функциональной характеристики других мембранных белков. Для успешного выполнения данной методики исследователям, впервые ее использующим, необходимо убедиться в оптимизации соотношения белка и липида для своей системы, в том не менее, что используемый белок обладает достаточной функциональностью, а также в создании достаточного градиента иодида на мембранах герметичных везикул.

Для подготовки липида сначала высушите 5 mg фосфатидилхолина яйца или egg PC в трубке из неборосиликатного стекла под током газа аргона в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем рассчитайте объем буфера 6, необходимый согласно текстовому протоколу, и добавьте буфер 6 непосредственно к липиду. Герметизируйте стеклянную трубку перфлором, после чего перемешайте содержимое на вортексе в течение двух минут при комнатной температуре для суспендирования липида в буфере.

Затем ресуспендируйте липид при комнатной температуре, используя шприц объемом 1 мл с иглой 25G, до полного исчезновения видимой липидной пленки со стенок пробирки. Буфер станет мутным из-за взвеси липидов. Обработайте липид в пробирке 22-м импульсом ультразвука в ультразвуковой бане с ледяной водой, после чего поместите пробирку на лед на одну минуту.

Повторите этот цикл три раза. Затем добавьте белок CFTR к липидам, чтобы конечный объем составил 1 мл. Смешайте белок с липидной суспензией, пропустив смесь через иглу 25G 10 раз.

Поместите образец на лед на 30 минут, аккуратно перемешивая содержимое пробирки путем вращения пять раз каждые пять минут в процессе инкубации. Отломите нижний выступ одноразовой спин-колонки для связывания детергентов и центрифугируйте колонку в течение двух минут при 2000 ×g. Для удаления буфера для хранения промойте колонку пятью миллилитрами буфера семь и центрифугируйте колонку в течение четырех минут при 2000 ×g для элюирования промывочного буфера.

Промойте колонку трижды, перенесите весь образец белково-липидного комплекса объемом 1 mL на верхний слой смолы колонки, затем инкубируйте колонку в течение двух минут при комнатной температуре. Центрифугируйте колонку при комнатной температуре в течение четырех минут при 2000 ×g. Затем перенесите мутный образец протеолипосом в чистую микроцентрифужную пробирку и поместите пробирку на лед. Замочите 5 g гранул Sephadex G-50 в 50 mL буфера 9 минимум на два часа при комнатной температуре.

Затем заполните четыре небольшие скрининговые колонки насыщенными бусинами, пока они не будут заполнены как минимум на три четверти. Центрифугируйте колонки в течение четырех минут при 2000 ×g, чтобы удалить из смолы избыток буфера. После центрифугирования в колонке должно остаться примерно 2,25 мл упакованной смолы.

Крайне важно, чтобы смола была надлежащим образом гидратирована для элюции с липосомами protea. Затем перенесите 125 µL образца липосом protea на верхнюю часть каждой колонки и центрифугируйте в течение четырех минут при 2000 ×g. Объедините EIT для использования в экспериментах iodide FLX.

Поместите небольшой флисовый магнитный перемешиватель в одну лунку 96-луночного планшета, затем добавьте в лунку 150 µL VX seven 70 в концентрации 20 µM в буфере nine. С помощью наконечника пипетки удалите все пузырьки воздуха. Затем добавьте в лунку 150 µL образца протеолипосом, чтобы общий объем составил 300 µL.

Поместите 96-луночный планшет на магнитную мешалку при скорости перемешивания 130 оборотов в минуту. Погрузите кончик иодид-селективного электрода в раствор, не касаясь магнитного якоря или дна лунки. Для регистрации кривых электродного сигнала пропустите сигнал через фильтр низких частот с частотой дискретизации 2 Гц; регистрируйте показания образца в течение пяти минут для достижения равновесного состояния.

Должна сформироваться стабильная, почти плоская базовая линия. Затем добавьте 3 µL стокового раствора Mg-ATP с концентрацией 100 мМ при pH 7. Для активации каналов CFTR дайте образцу уравновеситься еще в течение пяти минут до достижения новой базовой линии.

Затем добавьте 3 µL стокового раствора валиномицина в концентрации 2 µM для устранения электрохимического градиента, создаваемого активностью CFTR. Регистрируйте снижение напряжения, вызванное CFTR-опосредованным потоком иодида, в течение как минимум пяти минут.

Затем добавьте в образец три микролитра 10% раствора Triton X 100 в качестве контроля, чтобы высвободить иодид из просвета протеолипосомы. Значительный выход иодида указывает на то, что количество иодида, захваченного в везикулах, не было лимитирующим фактором для активности CFTR. После измерения образца приготовьте серию разведений иодида калия от микромолярных до наномолярных концентраций в буфере девять.

Начиная с наиболее разбавленного раствора, регистрируйте отклик электрода в милливольтах при каждой концентрации иодида для построения калибровочного графика. Для определения содержания иодида анализировали CFTR дикого типа. Активность потока F измеряли в нмоль в секунду после реконституции.

Поток иодида F значительно стимулируется в присутствии CFTR и A TP по сравнению с контролем без CFTR, а также при добавлении A TP. Когда CFTR фосфорилируется циклической A MP-зависимой протеинкиназой, каталитическая субъединица которой известна как PKA, напротив, предварительная обработка мощным ингибитором CFTR inhibitor 1 72 снижает скорость потока иодида. Способность VX seven 70 потенцировать поток иодида F CFTR дикого типа была протестирована без фосфорилирования и с фосфорилированием с помощью PKA. VX seven 70 увеличивал относительный поток иодида только в присутствии фосфорилированного CFTR. Эффективность VX seven 70 была проверена с использованием варианта CFTR, называемого Delta 5 0 8 CFTR; неактивный аналог V 0 9 11 88 не потенцирует активность фосфорилированного delta 5 0 8 CFTR, в то время как VX seven 70 увеличивает относительный поток иодида. После освоения эта методика может быть полностью выполнена — от очистки до измерения активности CFTR — в течение типичного восьмичасового рабочего дня; очистка CFTR занимает примерно четыре часа, а реконституция — еще один час перед началом анализа eFlex.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, включая анализ T PS и измерение проводимости в одноканальном режиме в паралипидных системах, используя тот же препарат белка CFTR для дальнейшей характеристики взаимодействия с малыми молекулами. Используя эти методы, исследователь муковисцидоза сможет ответить на ключевые вопросы в области модуляторов CFTR, а именно: взаимодействует ли данный модулятор напрямую с белком CFTR и каков механизм действия этого модулятора.