Получение одноклеточные подвесок для Cytofluorimetric анализа из различных регионов мышиной кожи

Общая цель этой процедуры заключается в получении суспензии одной клетки из кожи мыши для идентификации различных популяций резидентных иммунных клеток с помощью цитофлуориметрического анализа. Используя эту методику, исследователи могут легко переваривать образцы из разных участков кожи мышей без повреждения поверхности иммунных клеток, представляющих интерес

Чтобы получить образцы кожи из уха мыши, отрежьте безволосые части ушей и с помощью щипцов раздвиньте дорсальную и вентральную стороны органов. Затем аккуратно соскребите внутреннюю часть уха, чтобы удалить оставшийся хрящ. Чтобы получить образцы кожи на кусках, сбрейте всю шерсть животного с помощью машинки для стрижки, после чего нанесите лосьон для депиляции.

Через несколько минут счистите лосьон и сделайте вертикальный надрез посередине спинки мыши, продолжая разрез по границам выбритых участков вокруг тела мыши. Используя щипцы для удержания кожи на месте, отделяя образец с помощью закрытых кончиков хирургических ножниц или скальпеля с закругленными краями, аккуратно отделите кожу от мышц брюшины и спины. Затем погрузите кожу в 100-миллиметровую пластину для клеточной культуры, содержащую 10 мл ледяного PBS, и с помощью щипцов соскребите подкожный жир.

Чтобы получить образец кожи хвоста, отрежьте хвост и с помощью хирургических ножниц сделайте вертикальный разрез, начиная от основания хвоста вниз до кончика. С помощью щипцов возьмитесь за край разреза у основания хвоста, затем, обхватив тело хвоста еще одной парой щипцов, аккуратно потяните кожу к кончику. Удалите лишний жир, аккуратно соскребая образец кожи.

Нога мыши разрезается, а затем, чтобы получить образец кожи с подушечки стопы, с помощью хирургических ножниц разрезают кожу стопы в продольном направлении от лодыжки до начала пальцев, стараясь не срезать волосы. Затем обхватите щипцами кости лодыжки, одновременно захватывая кожу другой рукой, и потяните кожу к пальцам, как при снятии перчатки. Чтобы пометить клетки кожи, для каждого образца по очереди перенесите ткань в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую 2 миллилитра свежеприготовленного коктейля для пищеварения.

С помощью ножниц измельчите образец на мелкие кусочки и инкубируйте фрагменты ткани при температуре 37 градусов Цельсия в течение 90 минут с помощью одного-двух легких встряхиваний в течение инкубационного периода. Затем вылейте переваренную ткань кожи на клеточное ситечко размером 70 микрон в чашке Петри диаметром 66 миллиметров, содержащей 1 миллилитр RPMI 1640 с добавлением FBS на чашку. Промойте ситечко пятью миллилитрами свежей среды, затем с помощью поршня шприца выдавите образцы через сетку ситечка.

Промойте поршень, чашку и ситечко 20 миллилитров свежей среды и перелейте тканевую кашицу в коническую трубку объемом 50 миллилитров. После того, как все образцы были обработаны, центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулы по 100 микролитров на образец из двух микрограммов на миллилитр анти-CD16 CD32-блокирующего антитела в PBS плюс 1% FBS. Через 15 минут при четырех градусах Цельсия добавить 100 микролитров антитела, как указано в таблице, в соответствующие образцы на 30 минут при четырех градусах Цельсия, защищенных от света.

По окончании инкубации промойте клетки в одном миллилитре PBS плюс FBS и повторно суспендируйте гранулы в 300 микролитрах FBS PBS. Затем пометьте клетки 2 микрограммами на миллилитр DAPI на 10 минут при четырех градусах Цельсия в защищенном от света месте. Чтобы изолировать лейкоциты, сначала загните DAPI-положительную популяцию, чтобы уничтожить мертвые клетки.

Затем выберите синглеты в области прямого рассеяния с помощью графика ширины прямого рассеяния и закрутите ячейки на основе размера и зернистости интересующих лейкоцитов. Затем выберите CD45-положительные клетки, а затем для каждого образца определите популяции дендритных клеток кожи по их экспрессии CD11C и MHC второго класса. Макрофаги идентифицируются по экспрессии CD64 и F480, В-клетки — по экспрессии CD19 и MHC второго класса, а Т-клетки — по экспрессии CD4 или CD8.

Выделение иммунных клеток кожи, как только что было продемонстрировано, дает популяцию более 50% жизнеспособных клеток из всех областей кожи, от 5 000 до 15 000 на квадратный сантиметр из которых являются CD45-положительными. Достаточное количество дендритных клеток, макрофагов, В-клеток и Т-клеток также можно получить для последующего анализа из одного квадратного сантиметра кожи мыши, как показано. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как переваривать невоспаленную ткань кожи и выделять лейкоциты для факсимильного анализа.