Нормальных и злокачественных клетках мышц трансплантации в иммунной скомпрометированных взрослых данио рерио

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ подготовки и трансплантации нормальной и злокачественной мышечной ткани от трансгенных донорских рыб данио-рерио реципиентам — иммунодефицитным рыбам данио-рерио линии rag2. Трансплантация мышц начинается с выделения флуоресцентно меченных мышечных тканей путем диссекции дорсальной мускулатуры.

После гомогенизации мышц данио-рерио клетки фильтруют и готовят суспензию из отдельных клеток. Затем клетки трансплантируют внутримышечно мутантным рыбам данио-рерио линии rag2; далее с помощью эпифлуоресцентной микроскопии отслеживают приживление ткани в организмах реципиентов, начиная с 10-го дня после трансплантации. Аналогичным образом можно выделить первичную эмбриональную рабдомиосаркому, приготовить суспензию и ввести ее внутрибрюшинно мутантным рыбам данио-рерио линии rag2.

Затем с помощью микроскопии отслеживают приживление ткани, а размноженные опухолевые клетки можно использовать в последующих исследованиях. Основное преимущество трансплантации клеток взрослым иммунодефицитным данио-рерио заключается в том, что это обеспечивает универсальную платформу для аллотрансплантации различных тканей и типов опухолей. Ткани могут быть пересажены из различных генетических линий доноров без необходимости подавления иммунитета у рыб-реципиентов.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы биологии стволовых клеток и регенеративной биологии, такие как способность прогениторов к самообновлению. Эти методы также можно использовать для трансплантации опухолей мутантным рыбам rag2, чтобы затем идентифицировать новые химические соединения, которые, например, подавляют рост опухоли. Подготовку и трансплантацию нормальных и злокачественных мышечных клеток продемонстрируют Чин, Танг и Анес — два талантливых аспиранта из лаборатории LAL. Начните с забивания донорских данио-рерио с флуоресцентно меченной мышечной тканью. Один.

Типичные взрослые рыбы-доноры alpha с экспрессией RFP дают от 500 000 до 2 миллионов мышечных клеток. В нашем примере эксперимента мы используем 30 рыб-доноров для трансплантации 20 рыбам-реципиентам по одному миллиону клеток каждой. После эвтаназии рыбы-донора просушите животное, поместив его на одноразовое бумажное полотенце.

Используйте лезвие бритвы для забора дорсальной мускулатуры. Разрез следует делать под углом 45 градусов позади области анального отверстия, включая костную и кожную ткани; перенесите 10 забранных секций дорсальной мускулатуры в чистую чашку Петри. Затем добавьте 500 µL охлажденного буфера — суспензии 0.9 XPBS с 5% FBS.

Затем измельчите ткань до получения однородной суспензии, полностью гомогенизируя ее с помощью серологической пипетки объемом 5 мл, добавьте к гомогенату 2 мл суспензионного буфера, после чего 20 раз пропустите суспензию через пипетку. Далее отфильтруйте суспензию через сито с размером пор 40 мкм и соберите клетки в коническую пробирку объемом 50 мл на льду. До завершения процедуры поддерживайте клетки в охлажденном состоянии.

Промойте оставшуюся в сите ткань 2,5 миллилитрами суспензионного буфера и отфильтруйте ее в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Затем подсчитайте общее количество жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего и сконцентрируйте их центрифугированием при 1000 G в течение 10 минут при температуре четырех градусов Цельсия. После этого ресуспендируйте клетки в 0.9 XPBS с 5% FBS с концентрацией 333 000 клеток на микролитр.

Если количество донорских клеток ограничено, успешное приживление может быть достигнуто даже при введении всего 50, 000 клеток. Начните с анестезии рыб линии rag2-deficient в возрасте от двух до четырех месяцев в растворе трикаина. Когда движения жабр замедлятся и рыба станет неподвижной, перенесите ее на влажное полотенце левым боком вверх.

Теперь с помощью предварительно очищенного микрошприца объемом 10 µL с иглой 26 g введите 3 µL подготовленной суспензии мышечных клеток. Инъекции следует выполнять под углом 45 градусов непосредственно в дорсолатеральную мускулатуру рыбы-реципиента. Важно отметить, что при выполнении внутримышечной трансплантации общий объем вводимого в рыбу-реципиента вещества не должен превышать 3 µL. Затем осторожно перенесите рыбу-реципиента в резервуар для восстановления с чистой водой из системы содержания рыб.

Продолжайте вводить препарат остальным рыбам и поместите их в один резервуар для восстановления. Впоследствии оцените уровень приживаемости через 10, 20 и 30 дней после трансплантации с помощью светлопольной и эпифлуоресцентной микроскопии. Каждую опухоль обрабатывайте отдельно.

Проведите эвтаназию рыбы с эмбриональной рабдомиосаркомой. Поместите рыбу в чистую чашку Петри и иссеките опухоль из незлокачественных тканей с помощью лезвия бритвы и тонкого пинцета. Тщательное препарирование вокруг опухоли позволит получить клеточную суспензию более высокой чистоты с минимальным загрязнением окружающей мышечной тканью. Перенесите иссеченную опухоль в новую чашку и добавьте 100 µL предварительно охлажденного буфера — суспензии 0.9 XPBS с 5% FBS.

Затем измельчите ткань лезвием бритвы до получения однородной суспензии. Затем с помощью одномиллилитрового дозатора добавьте еще 900 µL буфера, после чего перемешайте содержимое. Несколько раз пропустите суспензию через наконечник дозатора для диссоциации клеток.

Теперь профильтруйте клетки через клеточный фильтр с размером пор 40 микрон. Промойте планшет, добавив еще два-четыре миллилитра суспензии и буфера, и профильтруйте через тот же клеточный фильтр. Сконцентрируйте клетки, как было описано ранее.

Держите клетки на льду. Затем ресуспендируйте клетки в 100 µL буфера и подсчитайте количество жизнеспособных клеток с помощью трипанового синего. Доведите концентрацию клеточной суспензии до 5 000 клеток на 1 µL.

Затем подвергните воздействию анестетика двух иммунокомпрометированных реципиентных зебраданио и поместите их на чистое бумажное полотенце вентральной стороной вверх. Используя очищенную иглу шприца калибра 26 G, введите необходимый объем в брюшную полость реципиентной зебраданио в этом месте.

Инъекцию проводят в объеме 5 µL, вводя 25 000 клеток. Тем не менее, возможна успешная инъекция объема до 10 µL. Перед возвратом в основную систему оставьте инъецированных рыб для восстановления в отдельном резервуаре.

Впоследствии в течение определенного времени наблюдайте за приживанием клеток у рыб-реципиентов с помощью эпифлуоресцентной микроскопии, после чего выделите клетки для последующих исследований. Согласно описанной процедуре, клетки скелетных мышц трансгенных доноров alpha actin RFP были пересажены иммунокомпрометированным гомозиготным мутантным zebrafish rag two. В результате из ткани скелетных мышц была получена суспензия единичных клеток, содержащая 84,3% жизнеспособных клеток, что было подтверждено методом исключения DPI.

После проведения проточной цитометрии было установлено, что RFP-положительные клетки составили 35,3% этой суспензии донорских клеток. Трансплантация клеток в дорсальную скелетную мышцу рыб-реципиентов, являющихся гомозиготными мутантами RAG two, привела к стабильному и выраженному приживлению трансплантата. Это было подтверждено образованием многоядерных флуоресцентных мышечных волокон у рыб-реципиентов; у рыб-реципиентов дикого типа приживления мышечных волокон не произошло.

Однако к 10-му дню после трансплантации у девяти из 14 мутантных рыб данио-рерио в области места инъекции обнаружились RFP-положительные мышечные волокна. Важно отметить, что прижившиеся RFP-положительные мышцы сохранялись как минимум до 30-го дня после трансплантации. Аналогичным образом, устойчивое приживление было получено после трансплантации эмбриональной рабдомиосаркомы (ERMS) мутантным рыбам RAG2.

Привитая ERMS имела общие гистологические признаки с первичной опухолью ERMS; гетерогенность опухолевых клеток сохранялась, что было подтверждено флуоресцентным анализом. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить мышечную и внутрибрюшинную трансплантацию нормальных и злокачественных тканей с использованием взрослых иммунодефицитных рыб в качестве реципиентов. В дальнейшем могут быть применены такие методы, как сортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортера, анализ трансплантации с лимитирующим разведением и ПЦР в реальном времени, для оценки функциональных и молекулярных различий между различными субпопуляциями опухоли.

В целом наш подход обеспечивает стабильное и долгосрочное приживление флуоресцентной мышечной и злокачественной тканей у иммунодефицитных рыб-мутантов RAG two. Преимущество данного метода заключается в том, что приживление происходит без предварительного иммуносупрессивного воздействия на рыбу-реципиента и не требует иммунологической совместимости животных-доноров и реципиентов.