Используя мышиный INDUCIBLE теломеразы аллелей в исследованиях ткани дегенерации / регенерации и Рака

Общая цель следующего эксперимента заключается в манипулировании двумя мышиными индуцируемыми маза, выбивающими аллели in vivo и in vitro для исследований дегенерации и регенерации тканей, а также исследований рака. Это достигается путем введения животным таблеток гидрокси тамоксифена для реактивации мазы in vivo. В качестве второго шага нейральные стволовые клетки выделяют из животных, которых затем обрабатывают гидрокситамоксифеном для реактивации mase in vitro.

Затем проводится флуоресценция теломер при С-2 гибридизации или рыбе как на культивируемых клетках, так и на формальных и фиксированных тканях мозга, залитых парафином, с целью проверки активности мазы. Результаты показали, что лечение гидрокситамоксифеном может надежно реактивировать активность мазы, что может как облегчить фенотипы старения, так и способствовать образованию опухоли на основе гистопатологического исследования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения и рака, например, можем ли мы замедлить процесс старения, модулируя активность травмы TH, или как конкретно нацелить Томаса на лечение рака.

Демонстрировать эту процедуру будут инструктор доктор Такаши Шингу и техник Эйприл Ун из моей лаборатории. Начните эту процедуру с создания Turt ER и заблокируйте аллели Turt, как описано в текстовом протоколе, простерилизуйте все хирургические инструменты перед инъекцией, чтобы приступить к обезболиванию мышей, как описано в текстовом протоколе. После достижения глубокой анестезии извлеките животное под наркозом из индукционной камеры и держите его голову внутри трубки, подключенной к изофторсодержащей камере.

Зажмите подушечки лап мышей, чтобы обеспечить глубокую анестезию животного. Также нанесите мазь на оба глаза. Для того чтобы глаза не вытягивались, протрите спину мышей раствором повидон-йода. Затем введите гранулу гидрокси тамоксифена с медленным высвобождением с помощью прецизионного троакара под кожу спины.

И протолкните дробину до самой средней линии между двумя плечами. Заклейте разрез аппликатором для зажима для раны и следите за мышами на предмет выздоровления. Для обезболивания.

Удалите однодневный мозг мыши и сохраните четыре мозга, удалив обонятельные луковицы и мозжечок. Храните четыре ткани мозга в одном миллилитре холодной питательной среды и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Убедитесь, что нервная ткань обработана в течение одного часа.

Определите вес ткани, чтобы убедиться, что предел в 400 мг на одно пищеварение не превышен. Поместите мозг на крышку чашки Петри диаметром 35 миллиметров и раздавите мозг с помощью скальпеля. С помощью наконечника для пипетки объемом один миллилитр добавьте один миллилитр раствора балансовой соли Хэнка или HBSS.

Затем пипеткой верните кусочки обратно в 15-миллилитровую пробирку после промывки центрифугой HBSS при 300-кратном G в течение двух минут при комнатной температуре. Аккуратно удалив надосадочную жидкость, добавьте 1 950 микролитров предварительно подогретого фермента. Смешайте один на 400 миллиграммов ткани.

Инкубируйте образец в 15-миллилитровой пробирке в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Перемешивайте образец, переворачивая или встряхивая пробирку каждые пять минут. Затем приготовьте 30 микролитров фермента Смешайте два на образец ткани, добавив 20 микролитров раствора, от трех до 10 микролитров раствора четырех.

Затем добавьте к образцу, аккуратно переворачивая, перемешайте, диссоциируйте ткани механически с помощью пипетки с широким наконечником из отполированной пасты путем пипетирования вверх и вниз 10 раз, медленно избегая образования пузырьков воздуха. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, переворачивая трубку каждые три минуты. Далее нанесите клеточную суспензию на клеточный фильтр 70 микрон, помещенный на 50-миллилитровую пробирку.

Нанесите 10 миллилитров фосфатно-солевого буфера или PBS через сетчатое фильтр. Затем выбросьте сетчатый фильтр и центрифугируйте клеточную суспензию при 300-кратном G в течение 20 минут. Установите комнатную температуру после центрифугирования, полностью отасуньте надосадочную жидкость.

Суспендирование клеток со средой стволовых клеток до необходимого объема для дальнейших применений для активации телематрицы в замках, остановки блокировок. Нейральные стволовые клетки Turt. Обрабатывайте клетки 100 микромолярными гидрокситамоксифенами в течение двух дней, чтобы активировать эмазу и нейронные стволовые клетки.

Выдерживают клетки в культуральной среде со 100 микромолярными гидрокситамоксифенами для выполнения теломер рыб. Во-первых, подготавливают метафазные хромосомы из культивируемых клеток для фиксированных формалином и парафином или срезов ткани с помощью FFPE. Депарируйте образец в ксилоле и регидратируйте в этаноловом ряду в течение пяти минут каждый и в PBS в течение пяти минут.

Затем закрепите срезы в соотношении метанол и уксусная кислота три к одному на один-два часа. Обезвожьте секции в холодной серии этанола в течение пяти минут каждая и постирайте на воздухе при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. Далее в природе хромосомы содержат 4% формальдегида при 37 градусах Цельсия в течение двух минут.

Обезвожьте срезы в холодном этаноле, как и раньше, и высушите на воздухе после высыхания, нанесите от 12 до 25 микролитров смеси для гибридизации пептидных нуклеиновых кислот на каждое предметное стекло. Запечатайте покровное стекло резиновым цементом, натуральным хромосомным препаратом и срезами тканей при температуре 80 градусов Цельсия в течение четырех минут. Затем гибридизируйте при комнатной температуре или 37 градусах Цельсия в течение двух-четырех часов во влажной камере.

Далее промойте образцы при комнатной температуре с промывочным буфером в течение 15 минут дважды. Затем постирайте их при комнатной температуре в течение пяти минут с помощью PBS и поднимите 23 раза. Наконец, закрасьте предметные стекла DPI или дальней красной флуоресценцией для микроскопического исследования.

Когда теломеры были временно реактивированы у мышей с дисфункциональными теломерами, дегенеративные фенотипы могли быть улучшены в нескольких органах, таких как мозг и яички, чтобы определить влияние реактивации теломер на клетки. Культивируемые in vitro нейральные стволовые клетки были выделены у мышей позднего поколения G с четырьмя блокировками, TURT и G four TURT ER. Когда теломеры были реактивированы в дисфункциональных нейральных клетках теломер, способность к самообновлению значительно увеличивалась.

Нейрогенез in vitro также был значительно усилен для определения влияния реактивации мазы на онкогенез в контексте дисфункции теломер, реактивация мазы путем лечения тамоксифеном проводилась на модели опухоли предстательной железы. Модель Т-клеточной лимфомы Эндота. Лечение привело к значительному усилению опухолевого генеза в обеих моделях.

Наконец, теломеры рыб были проведены на FFPE, тканях мозга мышей и метафазных хромосомах. На этих изображениях красный цвет указывает на окрашивание ДНК, зеленый — на окрашивание теломер, а голубой — на окрашивание центромеры. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как активировать травматическую активность в mTOR ER и блокировках стоп-замков, животных mTOR и клеточных линий, а также как использовать их для изучения ваших вопросов в области рака и агента.