Функциональная и морфологическая оценка диафрагмы иннервации диафрагмального по мотонейронов

Общей целью данной процедуры является количественная оценка как функциональной, так и морфологической иннервации диафрагмы диафрагмальными моторными нейронами шейного отдела спинного мозга. Это достигается путем регистрации потенциала действия сложных мышц из полудиафрагмы у животных, находящихся под наркозом, после сверхмаксимальной стимуляции ипсилатерального диафрагмального нерва. Следующим шагом является проведение иммуногистохимии всей диафрагмы для морфологической оценки иннервации отдельных нервно-мышечных соединений.

В конечном счете, сочетание потенциала действия сложных мышц и анализа нервно-мышечных соединений обеспечивает эффективный подход к количественному изучению диафрагмальной иннервации в моделях заболеваний ЦНС и ПНС у грызунов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области травмы спинного мозга, например, можно ли использовать терапевтические вмешательства для успешного восстановления функции диафрагмы? Применение этого метода распространяется на терапию таких заболеваний, как травматическое повреждение спинного мозга и ILS, потому что диафрагмальная дыхательная функция играет ключевую роль в исходе лечения пациента при обоих этих изнурительных состояниях. и Тамара Холла, техник-исследователь в моей лаборатории.

После обезболивания животного поместите его на операционную доску тыльной стороной вниз и закрепите передние конечности к доске. Затем сбрейте вентральную поверхность от основания черепа к брюшной полости по обе стороны от средней линии. После того, как кожа будет очищена, расположите электроды для крепления заземления к хвосту и поместите электрод сравнения в контралатеральную нижнюю часть живота подкожно.

Записывающий электрод должен быть подготовлен с помощью проводящего геля на самоклеящейся части и затем прикреплен вдоль одностороннего реберного края. Теперь расположите стимулирующие электроды, чрескожные на расстоянии полусантиметра друг от друга, сбоку от трахеи и выше ключицы. Они должны входить перпендикулярно коже и углубляться примерно на один сантиметр.

Эти электроды должны быть хорошо закреплены, лучше всего делать это вручную. Подсоедините все электроды к соответствующим им стимуляторам и усилителям. Собранные данные должны быть записаны на компьютер.

Для анализа установите параметры стимула стимуляции одного полюса равными 0,5 миллисекунды, сверхмаксимальные импульсы в один герц. Амплитуда может колебаться от шести до восьми вольт. Установите время стимуляции интереса равным 30 секундам и усредните реакцию от 10 последовательных стимуляций, используя исходный уровень до пиковой амплитуды от каждого животного примерно один раз в неделю, если это необходимо.

Обращение с животными подробно описано в текстовом протоколе. После усыпления животного с помощью передозировки инъекционной анестезии проведите лапаротомию с помощью скальпеля или ножниц. Сделайте надрез от мечевидного отростка по средней линии.

Затем с помощью скальпеля и щипцов аккуратно отделите кожу и соединительную ткань от мускулатуры. Удалите диафрагму, подтянув мечевидный отросток вверх и вырезав диафрагму из окружающей кости. Будьте осторожны, чтобы не повредить мышцу диафрагмы.

Перенесите верхнюю сторону диафрагмы вверх на чашку из силиконовой линии, заполненную 4% параформным альдегидом в PBS под стереоскопом. Прижмите ткани, окружающие диафрагму, натянув диафрагму натянуто. Затем удалите соединительную ткань с верхней поверхности с помощью щипцов и ножниц.

Дайте фиксатору подействовать в течение 20 минут, а затем снимите его с помощью трех 10-минутных промываний в PBS. Затем нанесите 0,1 молярного глицина с 2% BSA в PBS на 30 минут. Затем инкубируйте диафрагму в стержне Domine, конъюгированном растворе альфа бунгало в течение 15 минут.

Смойте бунгало токсином PBS, как это сделано для фиксатора. Затем смените ванну на холодный метанол и охладите ткань в течение пяти минут при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Через пять минут оперативно удалите метанол и промойте салфетку PBS, как и раньше.

Теперь примените блок с помощью раствора 0,2% TBP в течение одного часа. Замените раствор на первичное антитело в дозе 0,2% ТБ и дайте ткани инкубироваться в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия при легком перемешивании. На следующий день используйте три 10-минутных промывки в 0,2% TBP для удаления первичного антитела, а затем инкубируйте ткань в растворе вторичного антитела в течение часа с покачиванием, а в темноте позже используйте три промывки в PBS для удаления вторичного антитела и сохранения ткани в темноте.

Затем под помощью стереоскопа удалите больше соединительной ткани на верхней поверхности мышцы. После очистки установите и визуализируйте ткань под вертикальным эпифлуоресцентным микроскопом, количественно проанализируйте морфологию окрашенной полудиафрагмы. Используйте 20 и 40 кратное увеличение, потому что диафрагма анализируется как цельное крепление.

Большая часть флуоресцентного окрашивания находится не в фокусе. Используя стандартный микроскоп, лучше всего проводить анализ в режиме реального времени. Чтобы правильно оценить морфологию отдельных NM js, разделите мышцу на три отдела для анализа на основе топографических моделей иннервации спинного мозга.

Начиная с вентральной области, анализируйте все видимые njs вдоль мышечных волокон, не анализируйте глубже, чем первые три-четыре волокна от поверхности, потому что проникновение антител никогда не бывает полным. Интактный NMJ имеет толстый предконечный аксон, и все области нервного окончания полностью перекрываются с лежащими в основе мышцами ацетилхолиновыми рецепторами. При частично дезнервированном NMJ некоторые участки основных ацетилхолиновых рецепторов остаются незанятыми.

Полностью денервированный NMJ не будет показывать соответствия с ацетилхолиновыми рецепторами в нервном окончании. Другие NJS в этой области должны демонстрировать другую морфологию или успех антител Проникновение будет под вопросом, если более одного претерминального аксона иннервируют NMJ. NMJ умножается.

В этом случае могла произойти иннервация с последующей реиннервацией. Если в нервном окончании имеется перекрытие с лежащими в основе ацетилхолиновыми рецепторами и предконечный аксон очень тонкий, то NMJ тонко иннервируется. Это также является признаком отношений.

В эксперименте с участием взрослых крыс Долли контрольная группа получила ламинэктомию, в то время как другие получили односторонний ушиб ТСМ. В С четыре. Через пять недель была зарегистрирована пиковая амплитуда cmap от ипсилатеральной диафрагмы до места ламинэктомии или травмы.

Он был значительно снижен у крыс с ТСМ по сравнению с контрольными крысами, проведенными методом ламинэктомии, в другом эксперименте с участием крыс, экспрессирующих мутировавший человеческий белок, поэтому один белок D служил моделью LS. Морфология NMJ в полудиафрагме была полностью нетронутой у животных с контролем дикого типа. Тем не менее, у трансгенных крыс у njs наблюдалась значительная патология. Некоторые из них показали полную денервацию, отмеченную наконечником стрелы.

Другие nj были частично денервированы, как отмечено наконечником стрелы, и, как видно на NMJ справа, другие nj были многократно иннервированы, а другие имели тонкие предтерминальные аксоны, отмеченные здесь наконечником стрелы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как количественно оценить как функциональную, так и морфологическую иннервацию диафрагмы диафрагмальными моторными нейронами. Спасибо за просмотр и удачи во всех ваших экспериментах.