Долгосрочная прижизненные Многофотонная микроскопия изображений иммунных клеток в здоровых и больная печень Использование CXCR6.Gfp Reporter Мыши

Общая цель данного эксперимента состоит в том, чтобы проследить миграцию и взаимодействие лейкоцитов в прогрессирующем воспалительном заболевании печени. Лучше понять последовательность событий, лежащих в основе того, как эти клетки рекрутируются в ткань печени, и их потенциальное участие в иммунопатологии. Это достигается путем проведения трахеотомии, чтобы получить контроль над дыханием мыши, что является важным шагом для обеспечения долгосрочного выживания животного.

В качестве второго шага мыши проводится лапаротомия для хирургического обнажения печени, что дает доступ к органу с помощью многофотонного микроскопа. Затем печень фиксируется и позиционируется путем встраивания ее в возвышенность, чтобы свести к минимуму артефакты движения. Визуализация может выполняться в течение нескольких часов, что приводит к получению последовательностей с высоким разрешением, которые отслеживают изменения в наборе, позиционировании и взаимодействии отдельных лейкоцитов.

В процессе развития воспаления печени этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области острого и хронического воспаления печени, такие как рекрутинг лейкоцитов, взаимодействие клеточных клеток или механизмы иммунопатологии. Основное преимущество этой методики по сравнению с обычной микроскопией заключается в том, что мультифокальная микроскопия позволяет проводить долговременные визуализации практически без возмущения образца с низким обесцвечиванием жеребят или фототоксичностью, а также оптические срезы на глубине до 100 мкм в ткани, и это связано с уникальной физикой лазера дальнего красного лазерного света. Что ж, этот метод может дать представление о заболеваниях печени.

Его можно легко адаптировать к другим системам. Поскольку это метод стабилизации и фиксации, ткань может быть применена практически ко всем вопросам прижизненной микроскопии, благодаря чему она может легко визуализировать такие органы, как селезенка, почки или даже подкожные опухоли с использованием беглых родственных клеток. Также можно визуализировать все подмножества лейкоцитов и направить их взаимодействие и воспаление печени.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за чрезвычайной сложности хирургии мелких животных. Однако, по нашему собственному опыту, это всего лишь ограничивающий фактор на пару недель и просто требует некоторой рутинной работы Из-за хрупкости ткани печени этапы подготовки трудно освоить, и визуальная демонстрация метода имеет важное значение. После установки анестетиков заполните арену для мыши 3%aros, заливая ее под углом 40 градусов.

Затем убедитесь, что хирургическая рабочая зона полностью продезинфицирована, как и все необходимые инструменты и так далее. Затем обезболите мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции обезболивающего коктейля. Через пять минут проверьте рефлексы животного, а затем продезинфицируйте кожу и нанесите на глаза офтальмологическую мазь.

Теперь закрепите мышь на столе для подготовки. С помощью ленты расположите ее так, чтобы обнажить брюшную сторону, мягко перенатягивая шею. Это можно сделать с помощью резиновой ленты, прикрепленной к резцам.

Теперь выполните первоначальный разрез ниже подбородка длиной от 0,5 до одного сантиметра. Затем тщательно рассеките соединительную ткань между слюнными железами и найдите мышечную трубку, окружающую трахею. Аккуратно разорвите мышцу, чтобы обнажить трахею.

Протяните нить под трахею, затем вскройте трахею микроножницами с помощью Т-образного разреза в разрезе. Вставьте в вентиляционную трубку примерно на полсантиметра. Продвигайте трубку с помощью небольших анатомических щипцов.

Затем закрепите трубку швами. Затем для дополнительной безопасности пришите трубку к коже, запечатайте разрез на коже с помощью цианоакрилата и закрепите трубку на голове животного. Используя клейкую ленту, поддерживайте анестезию с помощью непрерывного потока 2% изофтора.

После подготовки мыши к операции сделайте небольшой разрез кожи ниже грудины и продлите разрез в боковом направлении ниже ребер с обеих сторон. Прижгите все оголенные кровеносные сосуды в этом процессе. Чтобы свести к минимуму кровотечение, выполните небольшой первоначальный разрез на линейном локте, чтобы получить доступ к брюшной полости.

Удлините разрез горизонтально, запечатав все кровеносные сосуды и дав доступ к печени. Теперь перенесите мышь на этап агро и сложите слайды по обе стороны от животного, чтобы помочь удержать его на месте. Эти стеки должны соответствовать высоте мыши, чтобы сцена для печени, которая будет размещена позже, не оказывала чрезмерного давления на живот

Теперь, используя швы в области грудины, втяните ребра. Четырех нулевых швов будет достаточно После втягивания ребер разрежьте связки, соединяющие печень, и разрежьте диафрагму до самой аорты, но работайте с особой осторожностью, чтобы не разорвать или не перерезать сосуд. Также разрежьте связку, которая соединяет печень и желудочно-кишечный тракт.

Поверните мышь на 45 градусов, чтобы улучшить доступ к большой доле печени. Возьмите стандартный чехол и обмотайте его по краям скотчем, чтобы он не был острым. Поместите его над брюшной полостью.

Это послужит сценой для того, чтобы печень могла расположить печень на сцене. Осторожно просуньте щуп с двойным шариковым щупом или мягким шпателем ниже печени и придерживайте верхнюю часть органа. Использование механического давления влажной ткани мгновенно приведет к повреждению ткани печени, поэтому важно обращаться с органом осторожно.

Затем поднимите мочек на предметное стекло и осторожно потяните его в нужное положение. Мочка обычно оказывается согнутой или сложенной, аккуратно попытайтесь развернуть края, приподняв ткань тонким шпателем или влажной салфеткой. Далее добавьте боковые опоры в виде покровных планок или горок.

Сложите крышки так, чтобы они были на высоте доли печени. Определение стадии и фиксация печени является наиболее важным этапом в протоколе. Любое механическое напряжение, скручивание или давление приведут к мгновенному повреждению тканей или, по крайней мере, нарушению кровотока в синусоидальных сосудах.

Теперь наденьте большую защитную накладку с заклеенными краями на долю печени, поддерживаемую боковыми опорами. Расположите эту защитную планку как можно ровнее. Он не должен сдавливать печень.

Белая ткань указывает на нарушение кровотока, если визуализация не будет проходить быстро. Теперь необходимо ввести два независимых внутрибрюшинных катетера для обеспечения длительной анестезии и применения G five. Они собраны из игл 27 калибра и гибкой силиконовой трубки.

Затем запускают их протекание с помощью шприцевых насосов. Вставьте катетеры в нижнюю часть живота рядом с задними конечностями. После подключения жизненно важных мониторов к мыши приготовьте 100 миллилитров 3%aros в одном XPBS.

Когда арос остынет до 41 градуса по Цельсию, вживите в него печень с помощью пятимиллилитрового шприца с иглой 18 калибра. Как только аэрос остынет, используйте шпатель Хайдемана, чтобы удалить излишки и открыть поле зрения, достаточно большое для сканирования печени. Затем приступайте к сканированию.

После того, как поле зрения подготовлено, переместите мышь под микроскоп, чтобы выбрать подходящие области сканирования для цейтраферной визуализации. Ткань печени сканируется на глаз с помощью внешнего источника белого света, идентифицирующего репрезентативные поля с достаточным кровотоком и минимальным возмущением образца CXCR Шесть гетерозиготных мышей GFP были подвергнуты прижизненной визуализации T-P-L-S-M в качестве эксперимента. Некоторым из них вводили внутрибрюшинную инъекцию тетрахлорида, чтобы вызвать острое повреждение печени.

Модальные клетки, экспрессирующие GFP, отслеживались с помощью видео, и их треки накладывались друг на друга, чтобы получить снимок клеточной подвижности. Затем треки были нормализованы. Нормальная печень имела клетки со случайными миграционными паттернами.

Печень, в которую вводили CCI 4, показала нарушение клеточной миграции. При измерении полного смещения от их происхождения было ясно, что через 36 часов после обработки CCI 4 в месте гепатоцеллюлярного повреждения произошло захват клеток. Нарушение миграции из-за повреждения печени также может быть показано путем построения графика скорости миграции отдельных клеток с течением времени, показывающего частичную остановку через 18 часов и полную остановку миграции через 36 часов.

Снижение скорости миграции клеток также может быть показано статистически значимым, когда клетки сравниваются как популяции. Таким образом, этот подход подходит для отслеживания изменений в миграции и позиционировании клеток при развивающихся заболеваниях печени. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить печень мыши к мультифотомикроскопии intra vital.

Метод, который мы здесь предлагаем, позволяет нам стабилизировать животное для долгосрочного выживания, а также свести к минимуму артефакты движения благодаря мягкому методу фиксации, который мы предлагаем. После маскировки эту технику можно выполнить примерно за час, если она выполнена правильно Во время этой процедуры важно контролировать жизненно важные параметры животных, стабилизируя температуру, частоту сердечных сокращений, уровень кислорода и CO2. Этого можно достичь, адаптируя глубину некроза и дыхания по данной методике.

Другие процедуры, такие как анализ проточной цитометрии или микродиссекция с лазерным захватом, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как фенотип инфильтрирующих иммунных клеток или медиаторов, секретируемых тканью, или инфильтрирующих клеток после их развития. Эти методы позволили исследователям получить представление о динамике движения лейкоцитов и клеточных взаимодействий в печени, что позволило проанализировать последовательность событий, приводящих к воспалительным заболеваниям печени. Пожалуйста, следуйте рекомендациям по безопасности лазера при визуализации с помощью высокоэнергетического импульсного инфракрасного лазера, используемого для многофотомикроскопии.

Убедитесь, что отражение лазерного излучения не может представлять опасность для ваших глаз и кожи во время выполнения этого эксперимента.