Долгосрочная прижизненные Многофотонная микроскопия изображений иммунных клеток в здоровых и больная печень Использование CXCR6.Gfp Reporter Мыши
24 марта 2015 г.
Стабильная прижизненная визуализация иммунных клеток печени с высоким разрешением является сложной задачей. Здесь мы предлагаем высокочувствительный и надежный метод изучения миграции и межклеточных взаимодействий иммунных клеток в печени мышей в течение длительных периодов времени (около 6 часов) с помощью прижизненной многофотонной лазерной сканирующей микроскопии в сочетании с мониторингом интенсивной терапии.
Общая цель данного эксперимента заключается в отслеживании миграции и взаимодействия лейкоцитов при прогрессирующем воспалительном заболевании печени. Это необходимо для более глубокого понимания последовательности событий, лежащих в основе привлечения этих клеток в ткань печени, и их потенциального участия в иммунопатологии. Для достижения этой цели сначала выполняется трахеотомия для контроля дыхания мыши, что является критически важным шагом для обеспечения долгосрочного выживания животного.
На втором этапе мыши проводят лапаротомию для хирургического обнажения печени, чтобы обеспечить доступ к органу с помощью многофотонного микроскопа. Затем печень фиксируют и позиционируют, помещая ее в розу, чтобы минимизировать артефакты движения. Визуализацию можно проводить в течение нескольких часов, что позволяет получить последовательности снимков с высоким разрешением и временным разрешением (time-lapse), позволяющие отслеживать изменения в рекрутировании, расположении и взаимодействии отдельных лейкоцитов.
При развитии воспаления печени данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области острого и хронического воспаления печени, такие как рекрутирование лейкоцитов, межклеточные взаимодействия или механизмы иммунопатологии. Основным преимуществом этого метода по сравнению с традиционной микроскопией является то, что мультифокальная микроскопия позволяет проводить длительную визуализацию практически без воздействия на образец, с низким уровнем фотообесцвечивания или фототоксичности, а также получать оптические срезы на глубину до 100 мкм в ткани, что обусловлено уникальными физическими свойствами дальнего красного лазерного излучения. Таким образом, этот метод позволяет получить ценные сведения о заболеваниях печени.
Этот метод может быть легко адаптирован для других систем. Благодаря способу стабилизации и фиксации ткани, данный подход может быть применен практически для всех задач интравитальной микроскопии, что позволяет легко визуализировать такие органы, как селезенка, почки или даже подкожные опухоли, используя флуоресцентно меченые клетки. Также возможно визуализировать все подмножества лейкоцитов, исследовать их взаимодействия и воспаление печени.
Как правило, специалисты, впервые применяющие данный метод, сталкиваются с трудностями из-за чрезвычайной сложности хирургических операций на мелких животных. Однако, исходя из нашего опыта, этот ограничивающий фактор сохраняется лишь в течение пары недель и преодолевается в процессе практической отработки навыков. Из-за хрупкости тканей печени этапы подготовки осваиваются с трудом, поэтому визуальная демонстрация метода имеет принципиальное значение. После введения анестетиков заполните столик для мыши 3% раствором ароматического вещества, вливая его под углом 40 градусов.
Затем убедитесь, что рабочая область для хирургического вмешательства, а также все необходимые инструменты и прочее полностью продезинфицированы. После этого проведите анестезию мыши путем внутрибрюшинного введения коктейля из анестетиков. Через пять минут проверьте рефлексы животного, затем продезинфицируйте кожу и нанесите офтальмологическую мазь на глаза.
Теперь зафиксируйте мышь на препарационном столе. С помощью ленты закрепите ее так, чтобы была открыта вентральная сторона, осторожно растянув шею. Для этого можно использовать резинку, зацепленную за резцы.
Теперь сделайте первый разрез под подбородком длиной примерно от 0,5 до одного сантиметра. Затем аккуратно распрепарируйте соединительную ткань между слюнными железами и найдите мышечную трубку, окружающую трахею. Осторожно разорвите мышцу, чтобы обнажить трахею.
Протяните нить под трахеей, затем вскройте трахею микроножницами, выполнив T-образный разрез в области первичного разреза. Введите вентиляционную трубку примерно на полсантиметра. Проведите трубку глубже с помощью малых анатомических пинцетов.
Затем зафиксируйте трубку швами. Для дополнительной надежности пришейте трубку к коже, закройте разрез на коже цианоакрилатом и закрепите трубку на голове животного. С помощью адгезивной ленты поддерживайте анестезию, используя непрерывный поток 2% изофлурана.
После подготовки мыши к операции сделайте небольшой разрез кожи ниже грудины и продлите разрез латерально под ребрами с обеих сторон. В процессе выполнения этой процедуры прижигайте все обнаженные кровеносные сосуды. Чтобы минимизировать кровотечение, сделайте небольшой начальный разрез в области белой линии живота для получения доступа в брюшную полость.
Произведите горизонтальный разрез, перетирая все кровеносные сосуды и обеспечивая доступ к печени. Теперь перенесите мышь на агро-платформу и поместите стопки предметных стекол по обе стороны от животного, чтобы зафиксировать его. Высота стопок должна соответствовать высоте мыши, чтобы платформа для печени, которая будет установлена позже, не оказывала избыточного давления на брюшную полость.
Теперь, используя швы в области грудины, раздвиньте ребра. Для этого будет достаточно шовного материала 4-0. После раздвигания ребер перережьте связки, соединяющие печень и диафрагму; делайте разрез до самой аорты, но соблюдайте предельную осторожность, чтобы не разорвать и не перерезать сосуд. Также перережьте связку, соединяющую печень и желудочно-кишечный тракт.
Поверните мышь на 45 градусов, чтобы облегчить доступ к более крупной доле печени. Возьмите стандартное покровное стекло и заклейте его края скотчем, чтобы они не были острыми. Поместите стекло над брюшной полостью.
Это будет служить подставкой для размещения печени. Осторожно просуньте под печень зонд со сдвоенным шариком или обтянутый мягким материалом шпатель и придержите орган сверху. Поскольку механическое давление даже через влажную салфетку может мгновенно повредить ткани печени, крайне важно обращаться с органом бережно.
Затем перенесите дольку на предметное стекло и осторожно подтяните ее, чтобы зафиксировать в нужном положении. Долька обычно оказывается слегка изогнутой или сложенной; аккуратно расправьте края, приподнимая ткань тонким шпателем или влажной салфеткой. Затем установите боковые опоры в виде покровных стекол или предметных стекол.
Сложите покровные стекла в стопку так, чтобы их высота совпадала с высотой доли печени. Позиционирование и фиксация печени являются наиболее важными этапами протокола. Любое механическое воздействие, скручивание или давление приведут к мгновенному повреждению ткани или, по крайней мере, к нарушению кровотока в синусоидальных сосудах.
Теперь накройте долю печени, зафиксированную с помощью боковых опор, большим покровным стеклом, края которого предварительно заклеены лентой. Расположите покровное стекло максимально горизонтально. Оно не должно сдавливать печень.
Белый цвет тканей указывает на нарушение кровотока, если только визуализация не будет проведена быстро. Теперь необходимо установить два независимых внутрибрюшных катетера для обеспечения длительной анестезии и подачи G five. Они собираются из игл 27-го калибра и гибких силиконовых трубок.
Затем запустите подачу растворов с помощью шприцевых насосов. Введите катетеры в нижнюю часть брюшной полости рядом с задними конечностями. После подключения мониторов показателей жизнедеятельности к мыши приготовьте 100 миллилитров 3%aros в одном XPBS.
Когда арос остынет до 41 °C, залейте им печень, используя шприц объемом 5 мл с иглой 18 G. После остывания аэроса используйте шпатель Хайдемана, чтобы удалить излишки и сформировать поле зрения, достаточное для сканирования печени. Затем приступите к сканированию.
После подготовки поля зрения переместите мышь под микроскоп, чтобы выбрать подходящие области сканирования для таймлапс-визуализации. Ткань печени сканируется визуально с использованием внешнего источника белого света для поиска репрезентативных полей с достаточным кровотоком и минимальным нарушением структуры образца. В качестве эксперимента была проведена интравитальная T-P-L-S-M визуализация мышей с гетерозиготным CXCR6-GFP. Некоторым животным вводили тетрахлорид внутрибрюшинно для индукции острого повреждения печени.
Клетки модального типа, экспрессирующие GFP, отслеживали с помощью видеозаписи, после чего траектории их движения накладывали друг на друга для получения общего представления о клеточной мобильности. Затем траектории были нормализованы. В нормальной печени клетки демонстрировали случайный характер миграции.
В печени после инъекции CCI four наблюдалось нарушение клеточной миграции. При измерении общего смещения от исходной точки стало очевидно, что через 36 часов после воздействия CCI four в месте повреждения гепатоцитов происходило захватывание клеток. Нарушение миграции вследствие повреждения печени также было продемонстрировано путем построения графика скорости миграции отдельных клеток с течением времени, который выявил частичную остановку через 18 часов и полную остановку миграции через 36 часов.
Снижение скорости миграции клеток также оказалось статистически значимым при сравнении клеточных популяций. Таким образом, данный подход подходит для отслеживания изменений в миграции и позиционировании клеток при развитии заболеваний печени. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготовить печень мыши для intravital мультифотонной микроскопии.
Метод, представленный здесь, позволяет стабилизировать животное для длительного выживания, а также минимизировать артефакты движения благодаря применению метода бережной фиксации. После проведения маскировки эта процедура занимает около одного часа при условии ее правильного выполнения. В ходе данной процедуры важно контролировать жизненно важные параметры животных: температуру стабилизации, частоту сердечных сокращений, уровень кислорода и CO2. Этого можно достичь путем регулирования глубины наркоза и параметров дыхания при использовании данной методики.
Для получения ответов на дополнительные вопросы, такие как фенотип инфильтрирующих иммунных клеток или медиаторы, секретируемые тканью или инфильтрирующими клетками после их развития, могут быть проведены другие процедуры, например, анализ методом проточной цитометрии или лазерная микродиссекция. Эти методы позволили исследователям изучить динамику трафика лейкоцитов и клеточных взаимодействий в печени, что позволило детально разобрать последовательность событий, приводящих к воспалительным заболеваниям печени. При проведении визуализации с использованием высокоэнергетического импульсного инфракрасного лазера для многофотонной микроскопии, пожалуйста, соблюдайте правила техники безопасности при работе с лазером.
При проведении данного эксперимента убедитесь, что отражения лазерного излучения не могут нанести вред вашим глазам и коже.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод стабильной интравитальной визуализации иммунных клеток печени с высоким разрешением, позволяющий наблюдать за их миграцией и взаимодействиями в течение длительного времени. Использование интравитальной многофотонной лазерной сканирующей микроскопии позволяет детально отслеживать поведение лейкоцитов на мышиной модели воспалительного заболевания печени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Интравитальная визуализация
Теоретические сведения
- Понимание динамики иммунных клеток при воспалении печени имеет решающее значение для изучения иммунопатологии.
- Для фиксации поведения лейкоцитов необходимы методы долгосрочной визуализации.
- Предыдущим методам не хватало чувствительности и надежности для длительных периодов наблюдения.
- В данной работе эти проблемы решаются с помощью нового подхода к визуализации.
Цель исследования
- Изучение миграции и взаимодействия лейкоцитов в печени.
- Выяснение механизмов привлечения иммунных клеток при воспалении печени.
- Предоставление надежного метода для долгосрочной визуализации иммунных ответов.
Используемые методы
- Трахеотомия для контроля дыхания мыши.
- Лапаротомия для обеспечения доступа к печени при визуализации.
- Погружение печени в среду для уменьшения артефактов движения.
- Интравитальная многофотонная лазерная сканирующая микроскопия для получения изображений с высоким разрешением.
Основные результаты
- Успешная долгосрочная визуализация миграции и взаимодействий лейкоцитов.
- Последовательности таймлапс-съемки с высоким разрешением зафиксировали изменения в поведении лейкоцитов.
- Данные о динамике привлечения иммунных клеток при воспалении печени.
- Продемонстрирована применимость данного метода для изучения иммунных ответов.
Выводы
- Разработанный метод представляет собой мощный инструмент для изучения динамики иммунных клеток.
- Он расширяет наше понимание роли лейкоцитов при заболеваниях печени.
- Данный подход может быть применен к другим моделям воспаления и иммунного ответа.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Долговременная интравитальная визуализация динамики иммунных клеток в печени позволяет снизить механистические риски при поиске мишеней для лечения воспалительных заболеваний печени за счет визуализации рекрутирования, локализации и взаимодействия лейкоцитов в режиме реального времени. Данный подход способствует валидации мишеней путем установления связи между поведением иммунных клеток, экспрессирующих CXCR6, и прогрессированием заболевания в доклинических моделях, что повышает прогностическую достоверность терапевтических гипотез. Описанный метод представляет собой релевантную модели заболевания систему для оценки иммуномодулирующих соединений в физиологически значимых условиях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем отслеживания миграции и позиционирования CXCR6.gfp+ иммунных клеток в здоровой печени и при патологиях.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию субпопуляций лейкоцитов, участвующих в иммунопатологии, посредством прямого наблюдения за межклеточными взаимодействиями.
- Научная ценность: способствует биологической минимизации рисков путем визуализации нарушенной миграции и задержки клеток в моделях повреждения печени, индуцированного CCl4.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные измерения зависимых переменных, таких как скорость миграции, общее смещение и частота взаимодействий, для скрининга соединений.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимые данные таймлапс-съемки высокого разрешения с минимальной фототоксичностью в течение 6-часовых окон визуализации.
- Операционная ценность: позволяет использовать стандартизированные протоколы подготовки и фиксации, что снижает вариативность между экспериментами и лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: связывает динамику иммунных клеток с прогрессированием заболевания путем корреляции поведения CXCR6+ клеток с острым и хроническим повреждением печени.
- Практическая ценность: облегчает валидацию доклинических моделей, обеспечивая возможность лонгитюдной оценки миграции лейкоцитов в интактной ткани.
- Научная ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров путем установления связи между данными визуализации и гистопатологическими результатами.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в непрерывный процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до доклинической оценки — обеспечивая динамический количественный анализ поведения иммунных клеток в релевантном микроокружении печени при соответствующем заболевании.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о механизмах привлечения лейкоцитов и стромальных взаимодействиях при воспалительных заболеваниях печени.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированную подготовку ткани, готовую к анализу, со стабилизацией жизненно важных показателей для обеспечения единообразия условий визуализации.
- Аналитика: предоставляет метрики на основе трекинга, включая скорость миграции, смещение и карты взаимодействий для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: связывают данные intravital-наблюдений с фенотипами заболеваний посредством корреляции с повреждением гепатоцитов, индуцированным CCl4.
- Повторное использование в исследованиях: метод может быть адаптирован для других органов и моделей заболеваний благодаря стандартизированной хирургической подготовке и платформе для intravital-визуализации.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет снижения механистической неопределенности в иммунопатологии, опосредованной лейкоцитами.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам анестезии, мониторинга показателей жизнедеятельности и заливки тканей.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет визуализации взаимодействия с мишенью и клеточного ответа в интактной ткани.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию иммуномодулирующих кандидатов с учетом рисков на основе прямого наблюдения за модуляцией иммунных клеток.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области микрохирургии, управления анестезией и работы с интравитальным микроскопом.
- Метод зависит от наличия многофотонных лазерных сканирующих микроскопов с перестраиваемым возбуждением в дальней красной области спектра и чувствительными детекторами.
- Необходима межкомандная стандартизация хирургической подготовки, мониторинга показателей жизнедеятельности и конвейеров анализа изображений.
- Адаптация к другим моделям требует валидации стабилизации тканей и экспрессии репортеров в целевых органах.
- Практические ограничения включают сложность хирургического вмешательства и необходимость специализированного обучения для поддержания жизнеспособности животных при длительной визуализации.
