Захват восстановления тканей в данио рерио Личинки с Интерв светлого стереомикроскопия

В этом видео демонстрируется метод захвата динамики восстановления тканей на стереомикроскопе с помощью покадровой съемки. Это достигается путем первого поднятия эмбрионов данио до личиночных стадий, когда хвостовой плавник достаточно развит до размеров, при которых можно легко проводить ампутации. Обычно это достигается после вылупления.

Вторым этапом является ампутация хвостового плавника с помощью иглы шприца. Третий шаг заключается в том, чтобы поместить личинки в камеру визуализации и сделать покадровый фильм на стереомикроскопе. Последним шагом является количественная оценка регенерации хвостового плавника с использованием программного обеспечения для анализа изображений, такого как Bit Plains S, или программного обеспечения с открытым исходным кодом для лабораторных исследований J.Hi.My, восстановления ран и регенерации тканей с использованием рыбок данио в качестве модели.

Сегодня мы продемонстрируем метод, который фиксирует динамику этих процессов в режиме реального времени с помощью светлопольной стереомикроскопии. Сегодня мы продемонстрируем метод, который фиксирует ранние процессы регенерации тканей с помощью хвостового плавника личинки данио-рерио. Представленный метод визуализации дает возможность наблюдать и анализировать поведение всей ткани в простой настройке микроскопа, которая легко адаптируется к любому стереомикроскопу, оснащенному возможностями покадровой съемки.

Итак, приступим. Выращивание данио-рерио до личиночных стадий. Заживление ран на хвостовом плавнике лучше всего наблюдать после стадии вылупления, так как хвостовой плавник к этому времени достаточно развит, и ампутации могут быть легко выполнены без повреждения спинного мозга или других тканей.

В непосредственной близости соберите яйца и инкубируйте их в инкубаторе с температурой 28 градусов Цельсия на ночь. На следующее утро удалите мертвые эмбрионы и промойте эмбриональной средой, содержащей 0,03% раствор раствора океанической аквариумной соли. При необходимости добавьте в блюдо зародышевую среду с 0,003% фено щитовидной железы для предотвращения пигментации личинок.

Для этой демонстрации мы дали эмбрионам развиваться в течение двух дней после оплодотворения в инкубаторе, когда личинки вылупятся из своих конов, подготовленных камерой визуализации. На этом этапе мы рассмотрим два метода создания камеры для визуализации. Первый способ состоит из камеры визуализации, изготовленной из ПВХ или тефлоновой трубки качества питьевой воды, которую можно приобрести в любом хозяйственном магазине.

Используйте трубки с внешним диаметром 25 мм и внутренним диаметром 20 мм, так как они имеют подходящий размер для крепления защитного стекла. Разрежьте трубку так, чтобы кольца толщиной 10 миллиметров получились как можно более ровными. С помощью наждачной бумаги сгладьте края и промойте в воде и этаноле.

Дайте камере высохнуть на воздухе. Второй метод состоит из использования предварительно изготовленной матовой стеклянной камеры для визуализации, стеклянной верхней части или изготовления камеры для визуализации из небольшой чашки Петри. Чтобы сделать свою собственную камеру для визуализации, используйте чашку Петри диаметром 35 или 50 миллиметров и просверлите 10-миллиметровое отверстие в крышке.

Затем нанесите силиконовую смазку на внешнюю сторону защитного стекла и прикрепите квадратный или круглый защитный лист размером 25 на 25 миллиметров к внешней стороне с помощью чистого наконечника для дозатора, чтобы убедиться, что крепление надежно закреплено. Во время процедуры визуализации прикрепите тонкую пластиковую сетку к внутренней стороне защитного стекла. Этого можно достичь, разрезав сетку по размеру диаметра внутреннего кольца, а затем вырезав небольшой прямоугольник, примерно в три раза превышающий размер личинок в середине сетки.

Монтаж и визуализация личинок до травмы. Этот этап подходит для последующего количественного определения регенерации ребер. Во-первых, приготовьте 0,5%-ный малоплавкий агрораствор в эмбриональной среде для иммобилизации образца, перенося обезболенную личинку в раствор aro, который поддерживался при температуре 42 градуса Цельсия.

В нагревательном блоке переложите личинок с каплей агроса в небольшую чашку Петри и расположите личинок на боку. Используя наконечник микрозагрузчика с крышкой, дайте аросу застыть и добавьте раствор Trica. Приступайте к стереомикроскопу, который будет использоваться позже.

Для покадровой съемки мы используем стереомикроскоп zes discovery V 12 и программное обеспечение Axio для демонстрации. Во-первых, отрегулируйте настройки микроскопа, выбрав подходящий объектив и увеличение для получения изображения. Затем выберите режим обнаружения камеры на микроскопе в программном обеспечении alvis.

Выберите режим реального времени, чтобы увидеть личинку на экране. Откройте окно свойств, чтобы автоматически определить яркость и вручную отрегулировать контрастность на базе трансиллюминации микроскопа. Выведите личинок из поля зрения и выберите функцию коррекции затенения.

Чтобы свести к минимуму фоновый шум, поместите личинок обратно в поле зрения и сделайте снимок. Сохраните изображение, чтобы подготовиться к нанесению ранения. Удалите личинки из арос, предварительно соскоблив аэрос с головы.

Это позволяет личинкам выскользнуть из аэроса, осторожно оттягивая голову от оставшегося анализа ампутации аэроса. Приготовьте 1,5%-ную пластину с использованием раствора раствора океанической соли. Под стереомикроскопом поместите личинки боком на застывшие арос и ампутируйте дистальную часть хвостового плавника иглой шприца 23 калибра.

Установка личинок для покадровой съемки. Мы представим два метода покадровой визуализации. В первом способе мы покажем, как изобразить личинок в кольце камеры после посадки личинок.

Осторожно соскребите затвердевшие овощи вокруг дистального хвостового плавника с помощью закрытого наконечника пипетки для микрозагрузчика. Это позволяет правильно заживлять раны или регенерацию тканей Не сковывая ткани, старайтесь не травмировать плавник повторно. Во время этой процедуры удалите нежелательный мусор, который мешает процедуре визуализации, из камеры, заменив его старым раствором.

Свежим раствором Trica нанесите силиконовую смазку на верхнюю часть камеры и заполните кольцо камеры свежим раствором Trica. Приложите предметное стекло к верху, чтобы запечатать камеру способом два. В этом методе мы покажем вам, как изобразить личинки в чашке Петри со стеклянной крышкой.

Закрепите личинок на крышке, накройте крышкой и заполните крышку. С помощью трика раствора. Соскребите агрос с хвостового плавника.

Далее нанесите силиконовую смазку на верхний край нижней камеры и заполните камеру раствором Trica. Осторожно сцедите раствор трика с крышки и переверните крышку, чтобы погрузить личинку в раствор трики нижней камеры, что можно сделать под небольшим углом. Чтобы избежать воздушных карманов, камера будет герметизирована с помощью силиконовой смазки, чтобы обеспечить поддержание надлежащей температуры в 28 градусов по Цельсию.

Соберите нагреваемую инкубационную камеру из картонной пузырчатой пленки для изоляции и проволочный купол, используемый для инкубации куриных яиц в качестве источника тепла. Поместите инкубационную камеру вокруг микроскопа и отрегулируйте температуру до 28 градусов по Цельсию. В течение 10–20 минут или до тех пор, пока температура не стабилизируется, откройте переднюю часть нагретой инкубационной камеры и поместите камеру визуализации на микроскоп.

Встаньте чехлом вверх к цели. Расположите личиночный плавник таким образом, чтобы две трети поля зрения оставались незанятыми, чтобы обеспечить захват роста и регенерации плавника в ходе процедуры визуализации. Не перемещая личинок в окне 60 многомерных данных программного обеспечения, выберите опцию «Стек Z» и «Интервальная съемка» на вкладке «Зак» и режиме среза.

Выберите толщину среза, а затем выберите режим старт-стопа. Определите верхнюю и нижнюю позиции стека в таблице интервальной съемки. Выберите интервал и продолжительность фильма, а затем нажмите кнопку «Старт», чтобы начать запись.

В течение первого часа проверьте границы и границы Зака личинок. При необходимости со временем переместите личинок, так как они могли сместиться из-за роста или различий в составе агроса. Сохраните файл в конце цейтраферной записи и перейдите к постобработке и количественному анализу данных.

В этом разделе мы обсудим несколько способов анализа данных, сгенерированных методом one imas. Во-первых, мы обсудим, как определить рост плавников с помощью программного обеспечения imas. Откройте цейтраферный фильм в программном обеспечении Amaris и сохраните файлы в формате MRS.

Чтобы повысить производительность программного обеспечения, выберите ортогональный вид для отображения фильма в виде проекции. Чтобы измерить длину плавника, выберите опцию «Добавить новые точки измерения» на верхней левой панели инструментов. В разделе Настройка списка видимых значений статистики выберите значения статистики, которые будут отображаться в режиме строки.

На вкладке настроек выберите пары в свойствах меток, выберите название и расстояние, чтобы отобразить расстояние между точками А и В рядом с линией измерения, переключитесь в режим редактирования и, удерживая нажатой клавишу Shift, выберите первую точку на дистальном плавнике. Затем используйте ту же конфигурацию для выбора второй точки на дистальном конце no accord. Расстояние будет отображаться на изображении и может быть экспортировано на вкладке статистики.

Выбрав кнопку экспорта диска в правом нижнем углу. В качестве альтернативы опции точек измерения, просмотрщик срезов может использоваться для измерения расстояний в режиме просмотра срезов. Прокрутите до нужной позиции и кликните по первой и второй позициям левой кнопкой мыши, отобразится расстояние.

Однако этот вариант не позволяет экспортировать данные. Теперь мы кратко обсудим, как определить площадь плавника с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом. Откройте фильм TimeLapse на изображении J с помощью плагина, который распознает формат файла Zeiss Axio.

В качестве альтернативы можно загрузить несжатую последовательность TIFF. Это гарантирует, что информация о файле будет сохранена в разделе «Анализировать» выбрать установленный масштаб для определения расстояния и пикселей, а также известного расстояния, если они не сохранены в файле. Кроме того, установите длину единицы измерения в микрометрах.

На панели инструментов. Выберите инструмент для выделения свободной руки и наметьте рану, удерживая левую кнопку мыши. При этом проводим по краям раны.

Нажмите на опцию измерения в разделе анализ, чтобы отобразить область репрезентативных результатов для раны. Ампутация плавника приводит к частичной регенерации в течение 36 часов после ампутации. Измерения площади плавника показывают, что ампутация плавника вызывает уменьшение ткани плавника примерно до 14 часов после ампутации, предположительно из-за гибели клеток, за которой следует тонкая длина регенерации.

Сравнение ампутированного и регенерированного плавника показывает увеличение длины плавника в 2,48 раза в течение 36 часов. Ампутация первоначально вызывает эффект кисетной струны, характеризующийся сокращениями через кабели актина, миозина, которые присутствуют в плавниковой складке, клетки выдавливаются из ампутационной раны и впоследствии очищаются. Длина тела изначально увеличивается, но плавник не регенерирует.

На ранних стадиях. Примерно через 14 часов после ампутации плавник начинает отрастать от проксимального к дистальному положению. Таким образом, наши результаты показывают, что ампутация вызывает сокращение раны, что может иметь важное значение для стимуляции экструзии клеток.

Как только процесс завершен, плавник начинает регенерировать. По-видимому, происходит рост плавников развития. Независимо от этого процесса, мы представили метод, который позволяет наблюдать за динамическими процессами восстановления тканей с использованием живых личинок данио-рерио.

Эта процедура требует определенных аспектов, которые мы протестировали, чтобы оптимизировать результат. Явным преимуществом представленного метода визуализации является то, что он легко адаптируется к любому стереомикроскопу, оснащенному ПЗС-камерой и программным обеспечением TimeLapse. Он также предлагает недорогую альтернативу более дорогой системе конфокальной визуализации.

Хотя в этом методе не используется флуоресценция или обнаружение клеток, он может быть расширен для таких применений за счет использования автоматизированной системы контроля осколков и программного обеспечения для деконволюции после визуализации для дальнейшего наблюдения за процессами восстановления и регенерации раны с субклеточным разрешением. Этот метод может дать студентам лучшее понимание основных биологических процессов, восстановления и регенерации основных тканей. Оптическая прозрачность и легкость, с которой можно использовать эмбрионы и личинки данио-рерио, а также адаптируемость системы к любому стереомикроскопу делают ее подходящей для преподавания основы биологии позвонков в классе.