Захват восстановления тканей в данио рерио Личинки с Интерв светлого стереомикроскопия

В данном видео демонстрируется метод регистрации динамики восстановления тканей с помощью стереомикроскопа и таймлапс-съемки. Для этого сначала эмбрионы данио-рерио выращивают до личиночной стадии, когда хвостовой плавник достаточно развит для проведения ампутации. Обычно это происходит после вылупления.

Второй этап заключается в ампутации хвостового плавника с помощью иглы шприца. На третьем этапе личинки помещают в камеру для визуализации и проводят таймлапс-съемку на стереомикроскопе. Заключительный этап — количественная оценка регенерации хвостового плавника с помощью программного обеспечения для анализа изображений, такого как Bit Plains S или бесплатного ПО Image J. Здравствуйте. В моей лаборатории изучаются процессы заживления ран и регенерации тканей с использованием данио-рерио в качестве модели.

Сегодня мы продемонстрируем метод регистрации динамики этих процессов в режиме реального времени с помощью стереомикроскопии в светлом поле. Мы покажем метод, позволяющий фиксировать ранние этапы регенерации тканей на примере хвостового плавника личинки zebrafish. Представленный метод визуализации дает возможность наблюдать и анализировать поведение тканей в целом масштабе с использованием простого микроскопа, который легко адаптировать к любому стереомикроскопу с функцией time-lapse съемки.

Итак, приступим. Выращивание zebrafish до личиночных стадий. Заживление ран в хвостовом плавнике лучше всего наблюдать после стадии вылупления, так как к этому времени хвостовой плавник достаточно развит, и ампутации можно легко провести, не повредив спинной мозг или другие ткани.

Соберите икру и инкубируйте ее в инкубаторе при температуре 28 °C в течение ночи. На следующее утро удалите погибшие эмбрионы и промойте их средой для эмбрионов, содержащей 0,03% раствора аквариумной соли Instant Ocean. При необходимости добавьте в чашку среду для эмбрионов с 0,003% фенилтиреоида, чтобы предотвратить пигментацию личинок.

Для данной демонстрации мы оставляем эмбрионы развиваться в инкубаторе до двух дней после оплодотворения, когда личинки вылупляются из своих хорионов, после чего приступаем к подготовке камеры для визуализации. На этом этапе мы предлагаем два метода изготовления камеры для визуализации. Первый метод предполагает использование камеры, изготовленной из ПВХ-трубки или тефлоновой трубки, подходящей для питьевой воды, которые можно приобрести в любом хозяйственном магазине.

Используйте трубки с наружным диаметром 25 mm и внутренним диаметром 20 mm, так как они имеют подходящий размер для крепления покровного стекла. Нарежьте трубку на кольца толщиной 10 mm, стараясь делать срезы максимально ровными. Используйте наждачную бумагу для заглаживания краев, после чего промойте их водой и этанолом.

Дайте воздуху в камере высохнуть. Второй метод заключается в использовании либо готовой imaging-камеры с матовым стеклянным дном и стеклянной крышкой, либо в изготовлении камеры из небольшой чашки Петри. Чтобы изготовить собственную imaging-камеру, возьмите чашку Петри диаметром 35 или 50 мм и просверлите в крышке отверстие диаметром 10 мм.

Затем нанесите силиконовую смазку на внешнюю сторону покровного стекла и прикрепите квадратное или круглое покровное стекло размером 25 by 25 мм к внешней стороне с помощью чистого наконечника пипетки, чтобы закрепительный гель оставался плотно прикрепленным. В ходе процедуры визуализации закрепите мелкую пластиковую сетку с внутренней стороны покровного стекла. Это можно сделать, вырезав сетку по размеру диаметра внутреннего кольца, а затем вырезав в центре сетки небольшой прямоугольник, примерно в три раза превышающий размер личинки.

Монтаж и получение изображений личинок до нанесения повреждения. Этот этап необходим для последующего количественного анализа регенерации плавника. Сначала приготовьте 0,5% раствор низкоплавкого агарозы в среде для эмбрионов для иммобилизации образца, перенеся анестезированную личинку в раствор агарозы, поддерживаемый при температуре 42 °C.

В нагревательном блоке перенесите личинки с каплей agros в маленькую чашку Петри и расположите личинки на боку. Используя наконечник микрозагрузчика с колпачком, дайте agros затвердеть и добавьте раствор trica. Перейдите к стереомикроскопу, который будет использоваться далее.

Для таймлапс-визуализации в данной демонстрации используются стереомикроскоп Zeis Discovery V 12 и программное обеспечение Axio Vision. Сначала настройте микроскоп, выбрав подходящий объектив и увеличение для получения изображений. Затем в программном обеспечении Axio Vision выберите режим детектирования камеры микроскопа.

Выберите режим живого наблюдения (live mode), чтобы увидеть личинку на экране. Откройте окно свойств для автоматического определения яркости или ручной настройки контрастности на просвечивающем основании микроскопа. Переместите личинок за пределы поля зрения и выберите функцию коррекции затенения (shading correction).

Чтобы минимизировать фоновый шум, снова поместите личинок в поле зрения и сделайте снимок. Сохраните изображение для подготовки к нанесению раны. Извлеките личинок из агарозы, предварительно счистив агарозу с головы.

Это позволяет личинкам легко выскальзывать из агароза, аккуратно оттягивая голову от оставшейся части. Подготовьте 1,5% агарозный слой, используя раствор соли Instant Ocean. Под стереомикроскопом поместите личинок на бок на затвердевший агароз и ампутируйте дистальную часть хвостового плавника иглой шприца 23G.

Фиксация личинок для таймлапс-визуализации. Мы представим два метода таймлапс-визуализации. В первом методе мы покажем, как проводить визуализацию личинок в кольцевой камере после их фиксации.

Осторожно счистите затвердевший agarose вокруг дистального хвостового плавника с помощью наконечника микропипетки с заглушкой. Это обеспечит правильное заживление раны или регенерацию тканей. Старайтесь не травмировать плавник повторно, не зажимая ткани. В ходе данной процедуры удалите из камеры ненужный мусор, который может помешать визуализации, заменив старый раствор.

Используя свежий раствор Trica, нанесите силиконовую смазку на верхнюю часть камеры и заполните кольцо камеры свежим раствором Trica. Сверху приложите предметное стекло, чтобы герметизировать камеру (второй способ). В данном методе мы покажем, как проводить визуализацию личинок в чашке Петри с стеклянным дном.

Закрепите личинок на предметном стекле с крышкой и заполните пространство под крышкой раствором trica. Соскребите агросы с хвостового плавника.

Затем нанесите силиконовую смазку на верхний край нижней камеры и заполните камеру раствором trica. Осторожно слейте раствор trica с крышки и переверните ее, чтобы погрузить личинку в раствор trica в нижней камере; это можно сделать под небольшим углом. Чтобы избежать образования воздушных пузырьков, камеру запечатают силиконовой смазкой для проведения таймлапс-визуализации с целью поддержания надлежащей температуры 28 °C.

Соберите камеру для нагрева, используя картон и пузырчатую пленку для изоляции, а также нагревательный купол с электронагревом, используемый для инкубации куриных яиц, в качестве источника тепла. Разместите инкубационную камеру вокруг микроскопа и установите температуру 28 °C. Через 10–20 минут или после стабилизации температуры откройте переднюю часть нагревательной камеры и установите камеру для визуализации на микроскоп.

Установите препарат так, чтобы покровное стекло было обращено вверх, к объективу. Расположите плавник личинки таким образом, чтобы две трети поля зрения оставались свободными; это необходимо для фиксации роста и регенерации плавника в процессе проведения съемки. В окне многомерного сбора данных (60 multi-dimensional acquisition) программного обеспечения, не перемещая личинок, выберите опцию Z-стека и таймлапса (Z stack and time-lapse) на вкладке Zack и в режиме срезов (slice mode).

Выберите толщину среза, а затем выберите режим старт-стоп. Определите верхнее и нижнее положение стека в таблице таймлапса. Выберите интервал и продолжительность видеозаписи, после чего нажмите кнопку пуска для начала записи.

В течение первого часа проверьте границы по осям X и Z для личинок. При необходимости перемещайте личинок по мере необходимости, так как их положение может измениться из-за роста или различий в составе агарозы. Сохраните файл по завершении записи таймлапса и перейдите к этапу постобработки и количественному анализу данных.

В данном разделе мы рассмотрим несколько способов анализа данных, полученных первым методом с помощью imas. Сначала мы обсудим, как определять рост плавника с помощью программного обеспечения imas. Откройте таймлапс-видео в программе Amaris и сохраните файлы в формате MRS.

Для повышения производительности программного обеспечения выберите ортогональный вид, чтобы отобразить видео в виде проекции. Для измерения длины плавника выберите опцию добавления новых точек измерения на панели инструментов в верхнем левом углу. В разделе настройки списка видимых статистических значений выберите значения статистики, которые должны отображаться в линейном режиме.

Во вкладке настроек (settings) в свойствах меток (labels properties) выберите «пары» (pairs), затем отметьте пункты «имя» (name) и «расстояние» (distance), чтобы отобразить расстояние между точками A и B рядом с линией измерения. Перейдите в режим редактирования (edit mode) и, удерживая клавишу shift, выберите первую точку на дистальном крае плавника. Затем, используя ту же конфигурацию, выберите вторую точку на дистальном конце хорды. Расстояние отобразится на изображении; его можно экспортировать во вкладке статистики (statistics).

Нажмите кнопку с изображением диска «export all» в правом нижнем углу для экспорта всех данных. В дополнение к опции точек измерения, для измерения расстояний в режиме просмотра срезов можно использовать slice viewer. Прокрутите до нужного положения и нажмите левой кнопкой мыши сначала на первую, а затем на вторую точку; после этого будет отображено расстояние.

Однако этот вариант не позволяет экспортировать данные. Теперь мы кратко обсудим, как определить площадь плавника с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом Image J. Откройте видеозапись TimeLapse в Image J, используя плагин, который распознает формат файлов Zeiss Axio vision.

В качестве альтернативы загрузите несжатую последовательность TIFF. Это позволит сохранить информацию о файле в разделе analyze select set scale, чтобы определить расстояние, количество пикселей и известное расстояние, если эти данные не были сохранены в самом файле. Также установите единицу длины — микрометры.

На панели инструментов выберите инструмент произвольного выделения и обведите рану, удерживая левую кнопку мыши. Обводку следует выполнять вдоль краев раны.

Выберите опцию «измерить» (measure) в разделе «анализ» (analyze), чтобы отобразить результаты измерения площади раны. Ампутация плавника приводит к частичной регенерации в течение 36 часов после процедуры. Измерения площади плавника показывают, что ампутация вызывает сокращение объема ткани плавника примерно до 14 часов после операции, что, вероятно, связано с гибелью клеток, после чего начинается постепенное увеличение длины регенерата.

Сравнение ампутированного и регенерированного плавника показывает увеличение длины плавника в 2,48 раза в течение 36 часов. Ампутация изначально вызывает эффект «затягивания шнурка», характеризующийся сокращениями актомиозиновых кабелей, которые присутствуют в клетках складки плавника, выходящих из раны при ампутации и впоследствии исчезающих. Длина тела изначально увеличивается, но плавник не регенерирует.

На ранних этапах, примерно через 14 часов после ампутации, плавник начинает расти в проксимально-дистальном направлении. Таким образом, наши результаты демонстрируют, что ампутация вызывает сокращение раны, которое может быть необходимым для стимуляции экструзии клеток.

По завершении процесса начинается регенерация плавника. Наблюдается рост плавника в процессе развития. Независимо от этого процесса, нами был представлен метод, позволяющий наблюдать динамические процессы восстановления тканей с использованием живых личинок zebrafish.

Данная процедура включает определенные аспекты, которые были протестированы нами для оптимизации результата. Явным преимуществом представленного метода визуализации является то, что он легко адаптируется к любому стереомикроскопу, оснащенному CCD-камерой и программным обеспечением для TimeLapse. Он также представляет собой недорогостоящую альтернативу более дорогостоящим системам конфокальной визуализации.

Хотя в данном методе не используются флуоресценция или детектирование клеток, его можно расширить для таких целей, используя автоматизированную систему контроля смещения и программное обеспечение для деконволюции изображений, чтобы более детально наблюдать процессы заживления ран и регенерации с субклеточным разрешением. Этот метод позволяет студентам лучше понять основные биологические процессы, лежащие в основе восстановления и регенерации тканей. Оптическая прозрачность, удобство использования эмбрионов и личинок zebrafish, а также адаптивность системы к любому стереомикроскопу делают этот метод подходящим для преподавания основ биологии позвоночных в учебных аудиториях.