Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Общая цель следующей процедуры заключается в расширении раковых стволовых клеток in vitro с использованием метода независимого культивирования Анкориджа, а затем в проверке метаболических эффектов новых методов таргетирования раковыми стволовыми клетками. Это достигается путем диссоциации образца ткани аденокарциномы поджелудочной железы человека в одноклеточную суспензию. На втором этапе опухолевую ткань далее расщепляют ферментами, а затем засеивают на желатиновую пластину. Чтобы удалить популяцию фибробластов, изолированные раковые клетки затем засеивают в многолуночную пластину со сверхнизким уровнем прикрепления и обрабатывают интересующим препаратом для оценки метаболической активности и формирования опухолевых сфер.

В конечном счете, представляющий интерес препарат может быть использован у мышей с ослабленным иммунитетом, вынашивающих ксенотрансплантаты, полученные от пациентов, для валидации эффектов препарата in vivo. Эти методы являются мощным инструментом для изучения биологии раковых стволовых клеток и служат первым шагом для разработки новых методов лечения раковых стволовых клеток. Демонстрировать процедуру буду я, младший научный сотрудник Центра стволовых клеток при раке и старении при Институте рака молочной железы, и Тини Круз, аспирант моей лаборатории «Выделение раковых стволовых клеток из протоковой аденокарциномы поджелудочной железы в стерильном шкафу биобезопасности».

С помощью стерильного скальпеля и щипцов измельчите человеческую опухоль в чашке для культуры размером 60 на 15 миллиметров, содержащей один миллилитр стерильного PBS, добавляя еще три-четыре миллилитра PBS по мере необходимости до полного диссоциирования ткани. Переложите тканевую суспензию в стерильную коническую пробирку и добавьте PBS до конечного объема в пять миллилитров. Затем механически гомогенизируйте образец с помощью диссоциационной центрифуги и расщепите гомогенизированную ткань коллагеназой при температуре 37 градусов Цельсия.

После часа центрифуги клетки восстанавливаются, суспензируя гранулу в 10 миллилитрах готовой среды. Отфильтруйте клеточную суспензию через ситечко 40 микрометров и снова опустите клетки. На этот раз ресуспендируйте гранулу в пяти миллилитрах КФК Через пять минут при комнатной температуре удалите буфер для лизиса эритроцитов центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в среде раковых стволовых клеток.

Затем инкубируйте клетки на чашке, покрытой желатином, при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы удалить большую часть быстро прикрепляющихся клеток фибробластов. Через час восстановите надосадочную жидкость и количественно определите количество жизнеспособных клеток рака поджелудочной железы, чтобы облегчить формирование опухолевой сферы для рака. Обогащение стволовыми клетками разбавляет клетки в соответствующем объеме среды раковых стволовых клеток до конечной концентрации от двух до 10-3 клеток на миллилитр и охлаждает их на льду в течение нескольких минут.

Затем, добавив 500 микролитров PBS в первый и последний ряды 24 клеточной пластины со сверхнизким уровнем прикрепления, повторно суспендируйте клетки с помощью пипетки и засейте один миллилитр клеток на лунку в пустые лунки планшета. Обработайте четыре лунки клеток интересующим препаратом и не менее четырех отрицательных контрольных лунок носителем. Затем инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение одной недели.

Через день добавляйте свежую обработку в наш автомобиль в каждую из скважин. На пятый или седьмой день оцените количество сформированных опухолевых сфер с помощью автоматического счетчика клеток, который позволяет идентифицировать более крупные структуры для серийной упаковки опухолевых сфер. На седьмой день используйте клеточное сетчатое фильтр 40 микрометров, чтобы собрать сферы.

Затем раскрутите шарики вниз и инкубируйте их в одном миллилитре трипсина в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы диссоциировать гранулу в одноклеточную суспензию. Затем разверните ячейки еще на семь дней, как только что было продемонстрировано, чтобы подготовить сферы к измерению их активных форм кислорода или продукции АФК после диссоциации, как только что показано, раскрутите сферы вниз и снова суспендируйте гранулу в HBSS, содержащем соответствующий зонд. После 20-минутной инкубации в темноте при температуре 37 градусов Цельсия поместите клетки на лед до анализа методом проточной цитометрии, чтобы подготовить сферы к измерению потребления ими кислорода.

Сначала нанесите 96-луночный клеточный культуральный планшет клеточным и тканевым клеевым клеем в течение не менее 20 минут при комнатной температуре. Затем диссоциируйте сферы и трипсин, как показано на рисунке. Затем промойте пластину два-три раза водой, чтобы удалить излишки клейкой пластины, единичные ячейки в три раза по 10 до пятых ячеек на лунку.

Через 150 мкл потребляемого кислорода пробирной среды анализа, содержащей глюкозу и пируват натрия, прилипают к клеткам на дно лунок методом центрифугирования до тех пор, пока не будет достигнуто 100-кратное G. Дайте центрифуге остановиться с отломом. Затем измените ориентацию тарелки на противоположную и повторите вращение.

Теперь инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия без углекислого газа. Тем временем загрузите импортный картридж для анализа. А, В и С. Вводите 25 микролитров трех, шести и девяти миллимолярных концентраций исследуемого препарата соответственно, и импортируйте D в дозе 25 микролитров одномикролярной концентрации митохондриального ингибитора рона.

Когда клетки будут готовы, откалибруйте картридж и загрузите планшет для культивирования клеток. В этих репрезентативных экспериментах лечение стволовыми клетками рака поджелудочной железы метформином сильно уменьшало размер и количество опухолевых сфер. Кроме того, эти сокращения были продемонстрированы культурами вторичной и третичной сферы.

Даже когда метформином обрабатывали только первичную культуру сферы, метформин, как сообщается, действует как митохондриальный ингибитор. Действительно, в этом эксперименте было обнаружено, что препарат индуцирует быстрое и дозозависимое снижение потребления кислорода опухолевыми клетками, что коррелирует с его способностью индуцировать выработку АФК. Важно отметить, что у мышей, получавших метформин, наблюдалось краткосрочное, но значительное снижение прогрессирования аденокарциномы поджелудочной железы по сравнению с контрольными животными.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как диссоциировать свежие опухоли человека. Выделите первичные раковые клетки, установленные в качестве культуры для формирования сфер, и оцените метаболическую активность стволовых клеток рака поджелудочной железы.