Инкапсуляция Термогенный преадипоциты для трансплантации в жировой ткани депо

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать инкапсуляцию термогенной катаболической клеточной линии и ее применение in vitro и, потенциально, in vivo. Для начала процедуры приготовьте суспензию клеток в альгинате натрия и перенесите ее в шприц объемом пять миллилитров. Следующим шагом является использование устройства для инкапсуляции с целью получения альгинатных микросфер.

Затем микросферы покрывают раствором поликатионного поли-L-лизина, после чего альгинатное ядро удаляют для формирования полупроницаемой мембраны вокруг суспензии клеток. Заключительным этапом является совместное культивирование инкапсулированных клеток с другими клеточными линиями или их введение в жировую ткань мышей. В конечном итоге анализ крови на иммунные показатели демонстрирует более высокую липолитическую активность в адипоцитах, которые культивировались совместно с микрокапсулами, содержащими адипоциты с дефицитом альдегиддегидрогеназы.

В то время как иммуногистохимия подтверждает успешную трансплантацию инкапсулированных клеток в жировую ткань мышей, данный метод позволяет получить представление о термогенезе и тканях. Его также можно применять к другим существующим моделям животных для создания недорогой экспериментальной модельной системы для тестирования подмножеств клеток in vivo. Для проведения биомедицинских исследований все процедуры должны выполняться в шкафу биологической безопасности второго уровня с ламинарным потоком воздуха.

Для начала удалите старую среду из флакона с клеточной культурой и промойте преадипоциты 10 миллилитрами PBS. Удалите PBS и ресуспендируйте клетки в двух миллилитрах 0.25%трипсина ЭДТА. Возьмите аликвоту объемом 10 микролитров из клеточной суспензии и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.

Согласно инструкциям производителя, добавьте DMEM к оставшимся клеткам для получения оптимального количества клеток и центрифугируйте при 480 ×g при комнатной температуре в течение пяти минут. После определения необходимого количества клеток в соответствии с указаниями в тексте протокола, мы суспендируем клеточный осадок в соответствующем объеме 2% раствора альгината натрия. Перенесите раствор клеток с альгинатом натрия в шприц объемом пять миллилитров.

Удалите из раствора все пузырьки воздуха и переверните шприц, чтобы создать воздушный карман объемом 1 мл. Для подготовки к инкапсуляции возьмите небольшой стакан, содержащий 144 мл 100 мМ раствора хлорида кальция. Под носиком иглы устройства для инкапсуляции закрепите электрод с объектом инкапсуляции так, чтобы кончик находился примерно в 2,5 см над поверхностью раствора хлорида кальция.

Плотно поместите шприц с раствором клеток в альгинате натрия в шприцевой насос. Присоедините резиновую трубку к отверстию шприца. Нажимайте на поршень до тех пор, пока раствор клеток в альгинате натрия не заполнит трубку наполовину.

Установите напряжение на уровне 5,4 kilovolts и задайте диаметр 12,06 millimeters на шприцевом насосе. Установите скорость подачи на три milliliters per hour. Запустите насос, включите систему инкапсуляции и поддерживайте напряжение на уровне 5,4 kilovolts.

Закройте окно вытяжного шкафа и избегайте любых излишних вибраций до полного завершения процесса формирования альгинатных микросфер. После того как весь раствор пройдет через иглу, оставьте сферические микросферы из альгината в растворе хлорида кальция для окончательного затвердевания еще на 20 минут, прежде чем приступать к покрытию их полианионным полилизином или PLL. Как только сферические микросферы из альгината натрия затвердеют, извлеките стакан с микросферами из устройства для инкапсуляции.

Перенесите микросферы в центрифужную пробирку объемом 50 мл. Удалите раствор хлорида кальция из осадка микросфер. Промойте микросферы, добавив 30 мл 0,9% раствора хлорида натрия и осторожно встряхнув пробирку вручную.

Дайте микросферам осадиться под действием силы тяжести. Затем с помощью пипетки на 25 мл удалите раствор хлорида натрия таким способом. Промойте микросферы в общей сложности три раза.

Затем добавьте раствор 0,05% PLL к микросферам. Используйте 10 миллилитров раствора PLL на каждый один миллилитр раствора альгината натрия. Перемешивайте на вортексе при 1000 об/мин в течение 10 минут, чего обычно достаточно для нанесения покрытия из PLL.

После подтверждения образования слоя PLL удалите раствор PLL и трижды промойте капсулы 0,9% раствором хлорида натрия, как было показано ранее. Чтобы сначала удалить альтернативное ядро из микросфер с покрытием PLL, добавьте в пробирку объемом 50 мл 30 мл 50 мМ раствора цитрата натрия. Подождите пять минут или до полного растворения альгината натрия. Трижды промойте капсулы 0,9% раствором хлорида натрия, как было описано ранее.

После третьей промывки перенесите в пробирку 20 мл культуральной среды, затем переместите все капсулы с клетками в флакон для культивирования клеток; инкубируйте инкапсулированные клетки в стандартных условиях культивирования. Клетки-хозяева для данной процедуры следует культивировать в 24-луночных планшетах до достижения конфлюэнтности. Используйте среду для роста фибробластов, приготовленную согласно описанию в сопроводительном протоколе.

Текст для культивирования преадипоцитов. Перенесите микрокапсулы в 24-луночный планшет с конфлюэнтными клетками-хозяевами, добавив микрокапсулы до достижения монослоя в каждой лунке; индуцируйте дифференцировку преадипоцитов с помощью дифференцировочной среды 1; инкубируйте в течение 48 часов.

Через 48 часов замените среду на среду для дифференцировки Differentiation Medium Two. Каждые 48 часов заменяйте среду на свежую среду для дифференцировки Differentiation Medium Two. Каждые 48 часов будет проводиться анализ клеточных белков методом вестерн-блоттинга.

Каждый этап производства микросфер может быть рассмотрен под микроскопом. Алгинатная микросфера показана при 20-кратном увеличении. До нанесения покрытия из ПЛЛ, после нанесения покрытия из ПЛЛ и после растворения сердцевины в количественном исследовании экспрессия адипоцитарной триглицеридлипазы или A TGL сравнивалась между тремя линиями адипоцитов 3 T 1, культивируемых совместно с микрокапсулами, содержащими бесклеточные адипоциты дикого типа или адипоциты с дефицитом альдегиддегидрогеназы 1 A 1.

Более высокая экспрессия A TGL в адипоцитах, совместно культивируемых с дефицитными по L DH one A one адипоцитами в микрокапсулах, указывает на более высокую липолитическую активность. В исследовании in vivo инкапсулированные клетки, меченные GFP, вводились в внутрибрюшное жировое депо мышей. Через 80 дней в введенной жировой подушке обнаружились окрашенные кластеры инкапсулированных клеток.

На парафиновом срезе жирового депо брюшной полости, окрашенном гематоксилином и эозином, видны скопления имплантированных клеток в микрокапсулах и адипоциты реципиента. Тот же срез при анализе в флуоресцентном свете демонстрирует помеченные GFP трансплантированные клетки внутри целых округлых капсул. Экспрессия GFP также служит индикатором жизнеспособности клеток после их развития.

Данный метод инкапсуляции открыл исследователям в области метаболических заболеваний возможность изучить возможные способы лечения ожирения, инсулинорезистентности при диабете второго типа, воспаления и рака на модельных организмах.