Методы по расследованию регулирующей роли малых РНК и рибосомного размещения в Малярийного плазмодия

Общая цель этой процедуры заключается в изучении роли микроРНК эритроцитов в посттранскрипционной регуляции генов транскриптов Plasmodium falciparum. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области малярии, например, как события сплайсинга РНК с малыми РНК хозяина или паразита могут повлиять на трансляционный потенциал слияния мРНК. Основным преимуществом этой методики является возможность захватывать полные и малые РНК вместе в одном пуле, демонстрируя наличие малых РНК и слитых РНК в одной клетке.

Кроме того, в этой процедуре используется полисомное профилирование, чтобы показать, как эти малые РНК влияют на трансляцию продуктов их слияния мРНК. Для начала наладьте трансфекцию путем сантифа 300 микролитров эритроцитов в полную малярийную среду в 800 раз G в течение пяти минут. Дважды промыть эритроциты средой RPMI ресуспендировать клетки в полной цитосмеси при 50% гематокрита.

Затем переведите клетки в режим электропорации и добавьте 10 микрограммов конъюгированной микроРНК биотина DYS th или неконъюгированной отрицательной контрольной микроРНК. Чтобы электропорировать клетки, поместите вете в электропоратор и подайте один импульс. Затем наложите пластины на клетки и заразните их Plasmodium falciparum через четыре часа, как описано в текстовом протоколе.

Затем добавьте 50 микролитров упакованных, очищенных авидов и шариков к 10 микрограммам РНК паразита в микроцентре пробирки, и инкубируйте пробирку с вращением в течение одного часа при четырех градусах Цельсия. Центрифугируйте полоску давана и шариков при 800-кратном G в течение 30 секунд, а затем промойте гранулу 500 микролитрами буфера РНП, содержащего разведение РНК от одного до 1000. Далее вымывайте РНК из бусин с помощью Resus, суспензируя их в 200 микролитрах РНК.

Захватите элюирующий буфер, содержащий избыток биотина. Инкубируйте бусины на ночь при температуре четыре градуса Цельсия с вращением. Затем центрифугируйте шарики при 800 умноженных на G в течение 30 секунд и соберите надосадочную РНК.

Критически важно делать элюирование с избытком биотина и использовать минимальное количество стрептококка и гранул для обеспечения должного специфического элюирования. Это снижает фоновое обогащение РНК. Наконец, определите степень обогащения транскриптов P. falciparum и обогащения микроРНК количественным R-T-P-C-R, как описано в текстовом протоколе, чтобы начать разделение полисом.

Сначала поместите пять миллилитров 50%-ного раствора сахарозы в ультрацентрифужную пробирку. Затем тщательно нанесите на 50%-ный раствор слой пяти миллилитров 15%-ного раствора сахарозы. Далее заклейте градиентную трубку перфилом и осторожно наклоните трубку до тех пор, пока она не ляжет горизонтально на столешницу.

Убедитесь, что трубка находится в устойчивом положении, чтобы предотвратить скручивание. Держите трубку в таком положении не менее двух часов, чтобы образовался градиент. В то же время соберите примерно 100 миллилитров асинхронной культуры крови, инфицированной плазмодием, в концентрации от 3 до 5%.

Затем добавьте 10 миллилитров питательной среды, содержащей два миллимоляра цикло, хайде, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем центрифугируйте клетки при 500-кратном G в течение семи минут, а затем дважды промойте их 80 миллилитрами PBS, содержащими 200 микромолярных циклоheide resus. Суспензируйте гранулу в PBS с циклогексимидом и положите на лед.

Гранулируйте ячейки и удалите надосадочную жидкость, чтобы оценить объем гранул. Затем лизизируют клетки в итоговом объеме 4,25 миллилитра лизиса, буферизуют и инкубируют в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия с вращением. Предыдущие попытки профилирования полисом и виды, вызывающие малярию, выявили в основном монос, потому что лизис понента приводит к распаду полисом на монозоны.

Здесь мы используем буфер для лизиса, который лизирует эритроциты и паразитов одновременно, чтобы сохранить полисомный рисунок Plasmodium falciparum, переносит лизат в микроцентрифужные пробирки, а затем вращает при температуре 16 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. В отдельную предварительно охлажденную пятимиллилитровую ультрацентрифужную пробирку добавьте 1,25 миллилитра холодного 0,5 молярного раствора сахарозы с помощью шприца с иглой 27 калибра. Аккуратно нанесите 3,75 миллилитров надосадочной жидкости над подушкой из сахарозы.

Центрифугируйте образец при температуре 366 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 146 минут. В течение этого времени медленно верните убитую сахарозой ультрацентрифужную пробирку в вертикальное положение и дайте ей постоять на льду не менее 15 минут. После снятия лизата с ультрацентрифуги тщательно соберите надосадочную жидкость в коническую двойку объемом 15 миллилитров.

Храните надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов Цельсия, чтобы сохранить фракцию РНК, не связанную рибосомами. Затем ресуспендируйте гранулу рибосомы в 500 микролитрах суспензии Resus, буферизуйте пипетированием в течение пяти минут для перемешивания центрифугирования образца при 16 000 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Чтобы удалить нерастворимый материал, осторожно снимите параметрический уплотнитель на градиентной трубке, чтобы не нарушить градиент, а затем наложите сверху рибосомальную суспензию с помощью шприца и иглы 27 калибра.

После центрифугирования пробирки при температуре 200 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 180 минут храните градиенты при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к загрузке в ректификационный агрегат. Поместите пустую ультрацентрифужную пробирку в градиентный ректификатор и промойте систему водой, не содержащей РНК, в течение пяти минут. Во время промывки установите чувствительность детектора поглощения ультрафиолета на 254 нанометра равным 0,2.

Хотя это, возможно, придется корректировать в зависимости от сигнала. Далее установите базовый сигнал на ноль при прохождении воды через датчик. После промывки коллектора направьте поток жидкости через ректификационный аппарат для опорожнения трубопроводов, а затем удалите пустую ультрацентрифужную трубку.

Пропустите 60% раствор сахарозы через ФРАКЦИОНАТОР до тех пор, пока он не выйдет из игольчатого аппарата. Затем поместите загруженную градиентную трубу в верхнюю часть загрузочной камеры и затяните уплотнение. Проткните иглой дно трубки.

Затем сбросьте скорость потока ректификационного аппарата до 12,5 на 10 и соберите 18-секундные фракции в микроцентрифужные пробирки. Запустите прямой поток 60% раствора сахарозы для элюирования фракций до того, как первая капля градиентного раствора попадет в микроцентрифужную пробирку. Начните сбор и запись в реальном времени поглощения на 254 нанометровом сигнале.

Когда абсорбирующий сигнал резко падает на границе раздела 50% и 60% раствора сахарозы, остановите поток и запись. Храните градиентные фракции при температуре минус 80 градусов Цельсия. Затем поворачивайте поток жидкости в обратном направлении, пока 60%-ный раствор не выльется из ультрацентрифужной пробирки.

Снимите трубку и начните анализ следующего градиента. Трансфекция эритроцитов микроРНК 4 5 1 с последующим восстановлением биотинилированных микро NA мРНК гибридов выявила обогащение слитых транскриптов PKAR. Фиктивная или неродственная трансфекция микроРНК не обогащала транскрипт PKAR.

Полученные данные показывают элюцианские пики 40s и 60 s рибосомных субъединиц, рибосому a DS и полисомные фракции, содержащие указанное количество рибосом. Рибосомы были связаны с транскриптами, выделенными из ЧКВ, находящимися внутри эритроцитов. Анализ крови по Нортеру показал, что рибосомы и полисома были связаны с 18 S и 28 SRNA.

Наряду с этой процедурой могут быть выполнены другие методы, такие как расщепление R nase H, анализы защиты рибонуклеазы и северный блоттинг, чтобы дополнительно подтвердить наличие микроРНК МРТ. Слияние NA. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как трансфектировать микроРНК в эритроциты и впоследствии захватывать малые РНК с общей РНК, включая химерные транскрипты. Вы также должны быть в состоянии восстановить полисомы, чтобы определить занятость рибосомов и, следовательно, трансляционный потенциал этих слитых транскриптов.