Картографирование судьбы

Биологи развития используют картирование судьбы в качестве инструмента для отслеживания клеточных линий по мере созревания организма. Это делается путем маркировки клеток на эмбриональной стадии, а затем отслеживания их и их потомства на протяжении всего развития организма. Картирование судеб также используется для изучения миграции и дифференцировки клеток во время развития, а также регенерации и восстановления во взрослом возрасте.

В этом видео будет представлен обзор картирования судьбы, объяснен протокол, используемый для создания карты судьбы у рыбок данио, и показаны некоторые способы применения этого метода в настоящее время в лабораториях.

Прежде чем перейти к процедурным деталям, давайте обсудим, что такое карта судьбы и как она строится.

В классических экспериментах по картированию судьбы ученые окрашивали группы клеток в раннем эмбрионе, например, в стадии гаструлы, красителем, который должен был быть передан всем потомкам этих клеток. Дав эмбриону развиваться в течение определенного периода времени, они рассматривали окрашенные клетки в более зрелом организме. Затем было отмечено расположение окрашенных клеток в зрелом организме. Обобщенные результаты нескольких подобных экспериментов позволили построить диаграмму, известную как карта судьбы.

Таким образом, карта судьбы — это общий план, в котором описывается судьба каждой части раннего эмбриона. Эти карты помогают ученым определить, какие эмбриональные клетки дифференцируются в какие функциональные взрослые клетки, и как они мигрируют и организуются в зрелые структуры.

Для создания карт судеб ученые использовали множество модельных организмов, в том числе лягушек, нематод, рыб, птенцов и мышей. Некоторые модельные организмы, такие как данио-рерио Danio rerio, имеют дополнительное преимущество в этом типе эксперимента. Поскольку они малы и остаются прозрачными на протяжении большей части процесса развития, ученые могут легко отслеживать клетки, рассматривая рыб под световым микроскопом. Важно отметить, что достижения в области методов маркировки клеток теперь позволяют ученым точно маркировать отдельные клетки и отслеживать их по мере развития организма, что помогает в создании чрезвычайно подробной карты судьбы.

Теперь, когда у вас есть представление о том, что такое карты судьбы, давайте обсудим протокол картирования судьбы у рыбок данио, который использует фотоактивацию. Этот относительно новый подход основан на фотоактивируемых белках. Это специальные флуоресцентные белки, которые находятся в «клетке», то есть удерживаются в определенной конформации для предотвращения флуоресценции. Применение управляемого лазерного импульса вызывает конформационное изменение, называемое «раскалыванием», которое приводит к видимой флуоресценции.

Для проведения этого эксперимента эти специализированные белки в клетках сначала синтезируются, а затем вводятся в одну или две клетки эмбрионов данио-рерио. Затем эмбрионам дают созреть до желаемой стадии развития до фотоактивации.

Затем, чтобы подготовить рыбу к фотоактивации, эмбрионы дехорионизируются, чтобы сделать ткань-мишень доступной. Далее они монтируются в оптически прозрачную среду, такую как агароза с низкой температурой плавления, которая надежно удерживает их в устойчивом положении. Образцы выравниваются так, чтобы обнажить интересующую область, и устанавливаются на микроскоп, оснащенный лазером. Лазерный импульс подается на целевую область, содержащую интересующие клетки, вызывая фотоактивацию.

После лазерной обработки эмбрионы осторожно извлекаются из агарозы и возвращаются в естественную среду обитания до тех пор, пока не будет достигнута желаемая стадия развития. Для того, чтобы проследить фотоактивированные клетки, эмбрионы снова помещают в агарозу с низкой температурой плавления, а затем фотоактивированные клетки могут быть визуализированы и прослежены с помощью прямой флуоресценции или иммуноокрашивания.

Теперь, когда у вас есть общее представление о протоколе картирования судьбы, давайте рассмотрим несколько лабораторных экспериментов, в которых используется эта процедура.

В дополнение к изучению эмбрионального развития, картирование судьбы может быть использовано для изучения репарации в зрелых системах. В этом эксперименте определенный подтип клеток был удален из сетчатки трансгенной рыбки данио. Затем ученые проследили генетически помеченные резидентные взрослые стволовые клетки, чтобы определить их судьбу после травмы. Наконец, был проведен анализ изображений, который продемонстрировал активацию взрослых стволовых клеток и последующее восстановление тканей.

Ученые также используют подобные протоколы, чтобы понять судьбу трансплантированных стволовых клеток. Здесь генетически помеченные человеческие эмбриональные стволовые клетки, или hESCs, были трансплантированы в модель мыши с ослабленным иммунитетом. Имплантированным клеткам позволяли дифференцироваться в течение 8-12 недель, после чего полученная тератома, представляющая собой опухоль, содержащую ткань из нескольких зародышевых слоев, была собрана, зафиксирована и иммуноокрашена для определения судьбы имплантированных стволовых клеток. Этот тип эксперимента помогает ученым подтвердить дифференцировочный потенциал культивируемых стволовых клеток in vivo.

Как уже говорилось ранее, ученые выполняют процедуры картирования судеб на различных модельных организмах, в том числе и на млекопитающих. В этом конкретном исследовании ученые отметили клетки в определенной области эмбриона мыши на ранних стадиях, используя индуцируемые генетические подходы. Это делается путем введения индуцирующего агента беременной мыши, вынашивающей генетически модифицированное потомство. Помеченные клетки отслеживались на более поздних стадиях развития, что помогло ученым определить их окончательную судьбу.

Вы только что посмотрели видео JoVE о картировании судьбы. В этом видео было дано некоторое представление о создании карт судеб, рассмотрен конкретный протокол картографирования судеб, а также обсуждены некоторые модификации и применения этого чрезвычайно полезного метода. Как всегда, спасибо за просмотр!