Физическая изоляция эндоспор из проб окружающей среды на целевой лизис вегетативных клеток

Общая цель данной процедуры заключается в выделении бактериальных эндоспор из сложных образцов микробного сообщества, таких как осадок Этот метод помогает ответить на ключевые вопросы в области микробиологии о наличии и распространенности эндоспор в природных образцах. Он основан на разнице в устойчивости эндоспор и вегетативных клеток к химическим веществам и теплу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что метод является неразрушающим для эндоспор, поэтому их можно использовать для последующих экспериментов, таких как культивирование, количественная оценка и метаболическое тестирование.

Несмотря на то, что мы разработали этот метод для работы с экологией эндоспоробразующих бактерий, он также может быть использован в таких областях, как экзобиология или пищевая промышленность, где споры могут быть как полезными, так и вредными. После приготовления растворов и оборудования в соответствии с текстовым протоколом, под стерилизованным УФ-шкафом биобезопасности используйте металлические совки, обожженные этанолом, чтобы добавить три грамма образца осадка в предварительно взвешенные, стерильные 50-миллилитровые пробирки. С помощью стерильной градуированной бюретки добавьте в образец 15 миллилитров стерильного, отфильтрованного 1%-ного гексаметафосфата натрия или раствора SHMP.

С помощью жидкостного диспергатора или гомогенизатора и стерильного диспергионного ротора гомогенизируйте образец при 17 500 об/мин в течение одной минуты. Дайте образцу отдохнуть две минуты и повторите гомогенизацию. Дайте образцу отдохнуть в течение 10 минут, чтобы самые тяжелые частицы осели.

Перелейте надосадочную жидкость, содержащую клеточную биомассу, в чистую 50-миллилитровую пробирку, стараясь не потревожить гранулу. Добавьте еще 15 миллилитров аликвоты SHMP в отстоявшуюся гранулу и повторите гомогенизацию перед сбором надосадочной жидкости и соединением ее с первой аликвотой. Центрифугируйте образец при 20-кратном G в течение одной минуты и переложите надосадочную жидкость в свежую 50-миллилитровую пробирку, прежде чем выбросить гранулу.

После того, как фильтрационная установка и вакуумный насос подготовлены в соответствии с текстовым протоколом, используйте этаноловое пламя для стерилизации щипцов, чтобы добавить стерильную нитроцеллюлозную мембрану в фильтрационную установку. Добавьте половину только что приготовленного образца надосадочной жидкости в установку мембранной фильтрации и используйте вакуумный насос для сбора клеток на мембране. Когда жидкость полностью пройдет через фильтр, остановите вакуумный насос.

С помощью стерилизованных щипцов аккуратно снимите мембрану и поместите ее в стерильную чашку Петри. Со свежим кусочком стерильной мембраны повторите фильтрацию с оставшейся половиной раствора. Чтобы отделить эндоспоры от вегетативных клеток в только что собранной биомассе, разморозьте мембрану, если она была заморожена, и с помощью этанола обгорели стерилизованными ножницами, чтобы разрезать ее на более мелкие кусочки.

Переложите кусочки мембраны в стерильную двухмиллилитровую пробирку и добавьте 900 микролитров 1X TE буфера. Тщательно перемешайте с помощью вортекса, чтобы освободить биомассу от мембраны. Инкубируйте пробирку при температуре 65 градусов Цельсия и 80 об/мин в течение 10 минут.

Затем извлеките трубку из инкубатора и дайте ей остыть в течение 15 минут. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленного лизоцима до конечной концентрации два миллиграмма на миллилитр и инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия и 80 об/мин в течение 60 минут, чтобы лизировать вегетативные клетки. После завершения лизиса добавьте в образец 250 микролитров 3 нормальных гидроксидов натрия и 250 микролитров 6% раствора SDS.

Инкубировать при комнатной температуре и 80 об/мин в течение 60 минут. Далее подготовьте стерильную фильтрационную установку, которая удерживает мембраны диаметром 25 миллиметров путем автоклавирования. После того как фильтрационная установка остынет, поместите на нее нитроцеллюлозную мембрану диаметром 25 миллиметров и диаметром 0,2 микрометра.

Добавьте образец на мембрану и с помощью вакуумного насоса отфильтруйте жидкость, захватывая эндоспоры на мембране, в то время как вегетативный материал клеток проходит через нее. Чтобы смыть остатки моющих средств, добавьте к мембране два миллилитра стерильного физиологического раствора и примените вакуумный насос. Когда жидкость будет полностью отфильтрована, выключите насос и оставьте мембрану на фильтрующем блоке.

Для проведения ДНКазной обработки непосредственно на мембрану добавьте 450 микролитров стерильной воды, 50 микролитров реакционного буфера 1X DNазы и 0,5 микролитра фермента DNазы и дайте ей настояться при температуре примерно 25 градусов Цельсия в течение 15 минут. Внеклеточная ДНК, ранее высвобожденная из лизированных клеток, переваривается ферментативным путем, а затем смывается. Это гарантирует, что конечный препарат эндоспор не содержит внешней ДНК, что является ключевым фактором для последующего анализа, такого как молекулярный анализ.

Важно помнить, что на фильтрующем аппарате не должно быть протечек, а проба не пересыхает. После инкубации добавьте один миллилитр физиологического раствора и включите насос, чтобы смыть остатки фермента с образца. Используйте стерильные щипцы для переноса мембраны, содержащей эндоспоры, в стерильную чашку Петри.

Проанализируйте образец в соответствии с текстовым протоколом. Продемонстрированный в этом видео протокол целенаправленного лизиса вегетативных клеток приводит к очищению образца эндоспор и значительному увеличению фракции эндоспоробразующих фирмикутов. При ампликонном секвенировании гена 16S рибосомальной РНК фирмикуты в необработанных образцах соответствуют только от 8% до 19% последовательностей.

Напротив, после лечения firmicutes составляли 90,6% и 83,9% выборки, богатой эндоспоринами. Два основных отряда эндоспорообразующих фирмикутов, бациллы и клостридиалы, были обогащены, в то время как неэндоспорообразующие фирмикуты, такие как лактобациллы, отсутствовали. Эффективность лечения также была продемонстрирована с использованием чистых культур.

Препарат эндоспор и вегетативная клеточная культура были обработаны, все клетки инкубированы и измерен рост с оптической плотностью 600 нанометров. Как показано здесь, рост наблюдался в культурах эндоспор, в то время как в обработанной культуре E.Coli рост не наблюдался, что указывает на необратимые повреждения вегетативных клеток. После освоения, и если растворы и оборудование были подготовлены заранее, эту технику следует сделать примерно за пять часов.

Важно помнить о том, что необходимо избегать любого загрязнения, работая в стерильных условиях и обеспечивая стерильность растворов и всего оборудования. После этой процедуры могут быть проведены другие методы, такие как культивирование, изоляция и метаболическое тестирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы об идентификации штамма и метаболическом потенциале эндоспор. Кроме того, можно провести экстракцию ДНК и метагеномное секвенирование для анализа видового разнообразия и наличия генов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как отделять эндоспоры от образцов окружающей среды. Не забывайте, что работа с моющими средствами, такими как SDS, может быть чрезвычайно опасной. Не забывайте надевать средства индивидуальной защиты.