ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий

Цели данного метода на основе ELISA заключаются, во-первых, в определении сродства связывания цитокина с его рецептором и, во-вторых, в измерении блокирующих эффектов ингибиторных пептидов взаимодействия лиганд-рецептор. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области взаимодействий белок-белок, таких как связывание цитокинов с рецепторами. Сродство связывания и блокировка этих процессов могут повысить общее понимание динамики взаимодействий.

Основным преимуществом этой методики является ее простота выполнения, она генерирует маркированные рецепторы и является относительно дешевой, что обусловлено легким доступом к готовым материалам, таким как элис-ридер. Хотя этот метод может предоставить представление об взаимодействии цитокинов с рецепторами, он также может быть применен к другим системам, таким как общие взаимодействия белок-белок и разработка блокирующих соединений для ингибирования специфических взаимодействий. Приготовьте растворы, как описано в протоколе текста.

Убедитесь, что фильтруете буфер для покрытия карбонатом с использованием мембраны PES с размером пор 0,22 микрон. Используйте вакуум. Также приготовьте 10 различных концентраций каждого лиганда или пептида.

В данном видео описано два анализа, первый - это прямое взаимодействие лиганд-рецептор, ELISA. Он может быть использован для измерения константы диссоциации рецептор-лиганд, которая представляет собой сродство связывания рецептор-лиганд. Второй анализ - это недавно оптимизированный конкурентный анализ взаимодействия лиганд-рецептор, ELISA.

Это позволяет проводить скрининг пептидов и других блокирующих соединений, которые действуют как ингибиторы взаимодействия рецептор-лиганд. Для повышения эффективности подготовьтесь использовать многоканальные пипетки для 96-лунковых пластин, а при декантации просто выливайте их содержимое. Начните процедуру с покрытия пластинки рекомбинантным рецептором.

Сначала разбавьте рецептор в карбонатном буфере до 100 нанограмов на микролитр. Затем загрузите колодцы пластинки 100 микролитрами раствора рецептора. Исключите наружные стенки, чтобы избежать артефакта края пластинки.

Накройте пластинку и инкубируйте ее при 4 градусах Цельсия на ночь. Проводите все инкубации пластинки с легким вращением. На следующий день удаляйте покрывающий раствор и промойте пластинку три раза с раствором для промывания, PBS с небольшой добавкой Твитена 20.

Затем заблокируйте свободные связывающие сайты рецептора, добавив 200 микролитров 5% PSA. Оставьте пластинку инкубироваться в течение двух часов при комнатной температуре для завершения блокировки. Затем вылейте колодцы и промойте пластинку, как и раньше.

Теперь загрузите колодцы 100 микролитрами различных разбавлений рекомбинантного лиганда с гисто-тэгом. Загрузите каждую концентрацию по два раза. Загрузите пустые колодцы только с PBS.

Затем инкубируйте пластинку в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации с лигандами промойте пластинку три раза с раствором для промывания. Затем пипеткой наберите 100 микролитров первичного антитела мыши моноклонального против гисто-тэга в каждое колодце и инкубируйте пластинку при комнатной температуре в течение двух часов.

После промывания антитела, в каждое колодце добавьте 100 микролитров свежеприготовленного TMB, изготовленного из равных объемов субстратных растворов A и B. Затем оставьте пластинку при комнатной температуре в течение 15-30 минут. Затем, после достаточного развития окраски, добавьте в каждое колодце 50 микролитров раствора субстрата.

Протокол основан на предположении, что сигнал, измеренный, возникает от специфической связи. Может потребоваться оценка вклада неспецифической связи в сигнал. Затем считайте значения абсорбции пластинки на 450 нанометрах и приступайте к расчету значения KD.

Процедура конкурентного LRA следует тем же шагам, что и прямой LRA, за исключением нескольких важных изменений. После промывания избытка связывающих лигандов с пластинки заблокируйте колодцы пластинки. Добавьте 200 микролитров 5% раствора BSA в каждое колодце и инкубируйте пластинку в течение двух часов при комнатной температуре.

Во время инкубации приготовьте рекомбинантные лиганды с гисто-тэгом с фиксированной концентрацией 10 нанограмов на миллилитр в PBS. Затем приготовьте блокирующий пептид в различных концентрациях в PBS, начиная от 10 наномоляр до 100 микромоляр, чтобы гарантировать кривую дозы-ответа. Таким образом, можно найти значение IC50 для блокирующего пептида.

В контрольных колодцах загрузите фиксированную концентрацию лиганда без пептида для получения максимального связывания. В пустых колодцах добавьте только PBS без лиганда