ELISA на основе связывания и метод конкуренции быстро определить лиганд-рецепторных взаимодействий

Целями этого метода, основанного на ИФА, являются, во-первых, определение аффинности связывания цитокина с его рецептором и, во-вторых, измерение блокирующих эффектов ингибирующих пептидов лиганд-рецепторного взаимодействия. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области белок-белковых взаимодействий, таких как связывание цитокинов с рецепторами. Сродство связывания и их блокада могут улучшить общее понимание динамики взаимодействия.

Основным преимуществом этой методики является то, что она проста в выполнении, генерирует рецепторы меток, и она относительно дешева, благодаря легкому доступу к легкодоступным считывателям, таким как ИФА. Хотя этот метод может дать представление о взаимодействии цитокиновых рецепторов, он также может быть применен к другим системам, таким как общие белок-белковые взаимодействия и разработка блокирующих соединений для ингибирования специфических взаимодействий. Приготовьте растворы, как описано в текстовом протоколе.

Обязательно отфильтруйте буфер для карбонатного покрытия с мембраной PES толщиной 0,22 микрона. Используйте пылесос. Кроме того, сделайте 10 различных концентраций каждого лиганда или пептида.

В этом видео описаны два метода, первый из которых связан с прямым лигандным рецепторным взаимодействием, ИФА. Его можно использовать для измерения константы диссоциации рецептор-лиганд, которая представляет собой аффинность связывания рецептор-лиганд. Второй анализ представляет собой недавно оптимизированный ИФА для конкурентного лиганд-рецепторного взаимодействия.

Это позволяет проводить скрининг пептидов и других блокирующих соединений, которые действуют как помехи рецептор-лигандному взаимодействию. Для повышения эффективности приготовьтесь использовать многоканальные пипетки для 96-луночных планшетов, а при декантации просто высыпать их содержимое. Начните эту процедуру с покрытия пластины рекомбинантным рецептором.

Сначала разведите рецептор в карбонатном буфере до 100 нанограмм на микролитр. Затем загрузите в лунки пластины 100 микролитров рецепторного раствора. Исключите внешние стены, чтобы избежать артефакта кромки пластины.

Накройте тарелку крышкой и выдержите ее при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи. Выполняйте все инкубации планшетов с аккуратным вращением. На следующий день удалите раствор для покрытия и трижды промойте пластину раствором для промывки, PBS с прикосновением Tween 20.

Затем заблокируйте свободные сайты связывания рецепторов, добавив 200 микролитров 5% ПСА. Дайте тарелке поинкубироваться в течение двух часов при комнатной температуре, чтобы завершить блокировку. Позже опустошите лунки и вымойте тарелку, как и раньше.

Теперь загрузите в лунки 100 микролитров различных разведений рекомбинантного лиганда his-tag. Загрузите каждую концентрацию в двух экземплярах. Загружайте глухие колодцы только с помощью PBS.

Затем выдержите тарелку в течение двух часов при комнатной температуре. После инкубации с лигандами трижды промыть пластину промывочным раствором. Затем пипеткой нанесите в каждую лунку 100 микролитров аликвот первичного моноклонального антитела против мыши и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение двух часов.

После вымывания антитела в каждую лунку добавьте по 100 микролитров раствора вторичного антитела против мышей IGG связанного HRP. Оберните тарелку алюминиевой фольгой, чтобы избежать попадания света. Затем выдержите тарелку в течение 45 минут при комнатной температуре.

Используйте стандартную технику промывки для удаления вторичного антитела. Теперь в каждую лунку добавьте по 100 микролитров свежеприготовленного ТМБ, приготовленного из равных количеств исходных растворов субстрата А и В. Затем подержите пластину при комнатной температуре от 15 до 30 минут. Затем, после достаточного раскрытия цвета, добавьте в каждую лунку по 50 микролитров исходного раствора.

Протокол основан на предположении, что сигнал, передаваемый в сообщение, возникает из-за определенной привязки. Может потребоваться оценка вклада неспецифического связывания в сигнал. Затем считайте значения поглощения пластины на 450 нанометрах и перейдите к расчету значения KD.

Процедура ЛРА для конкуренции состоит из тех же этапов, что и процедура прямого ЛРА, за исключением нескольких важных изменений. Смыв излишки лигандов покрытия с пластины, закупорьте пластину лунками. Добавьте 200 микролитров 5%-ного раствора БСА в каждую лунку и инкубируйте планшет в течение двух часов при комнатной температуре.

Во время инкубации приготовьте рекомбинантные лиганды his-tag в фиксированной концентрации 10 нанограмм на миллилитр в PBS. Затем приготовьте блокирующий пептид в различных концентрациях в PBS, в диапазоне от 10 наномоляров до 100 микромоляров, чтобы гарантировать кривую «доза-ответ». Таким образом, можно найти значение IC50 для блокирующего пептида.

В контрольные лунки загрузите фиксированную концентрацию лиганда без пептида для получения максимального связывания. В глухие лунки добавляйте только PBS без лиганда или пептида. В другие лунки добавьте по 50 микролитров лигандов и по 50 микролитров пептидов каждой концентрации.

Затем выдержите тарелку в течение двух часов при комнатной температуре и действуйте как обычно. Константы диссоциации между тремя различными пептидами лиганда интерферона и субъединицей рецептора альфа IL28R-a определяли с помощью прямого LRA, фракция занятых сайтов связывания была построена в зависимости от логарифма соответствующей концентрации интерферона. Эти результаты иллюстрируют кривую привязки, которую можно проанализировать для оценки значения KD путем подгонки данных к уравнению Хилла.

График Скэтчарда иллюстрирует кооперативность в связывании лиганда, в конечном итоге интерфероновый лиганд 1 имеет наибольшее сродство к связыванию, за ним следуют интерфероновый лиганд 2 и интерфероновый лиганд 3. Значение коэффициента Хилла, равное более 1, предполагает повышенное сродство к дополнительным лигандам после начального взаимодействия с рецептором лиганда. Затем был использован конкурентный LRA для количественной оценки влияния блокирующего пептида на взаимодействие между пептидами лиганда интерферона и субъединицей рецептора.

Доля занятых сайтов связывания пептида интерферона лиганда в концентрации 10 нанограммов на миллилитр построена в зависимости от логарифмической концентрации пептида интерферона. На основе этих данных были оценены значения IC50. Согласно расчетным значениям, блокирующий пептид в наибольшей степени ингибировал взаимодействие между лигандом интерферона 3 и IL28R-a.

Одолев эту технику, можно сделать за восемь часов. Если она выполнена правильно. При попытке проведения этой процедуры важно помнить, что каждая насыщенная концентрация связывания лигандного рецептора, после этой процедуры, могут быть выполнены другие методы для получения более детальных значений KD.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области лиганд-рецепторных взаимодействий к изучению ингибирующих веществ, блокирующих эти взаимодействия.