Меры предосторожности и эксплуатационные процедуры в (A) BSL-4 лаборатории: 2. Общие правила

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать правила техники безопасности при работе в лаборатории 4-го уровня биобезопасности на примере метода определения количества бляшек (плак-анализа). В данной процедуре показаны модификации, необходимые для проведения стандартного плак-анализа в условиях 4-го уровня биобезопасности. Процедуру вместе со мной продемонстрирует Трейси Бердетт, техник из Интегрированного исследовательского центра (Integrated Research Facility).

После выполнения ежедневного контрольного списка проверки внутренних систем очистите бокс биологической безопасности II класса, распылив внутри, включая смотровое окно, 5% раствор дезинфицирующего средства на основе двойных четвертичных аммониевых соединений. Затем протрите бокс бумажными полотенцами, обязательно оставив внутри флакон с дезинфицирующим раствором, чтобы распылять его на перчатки во время и после проведения анализа. Распылите 70% раствор этанола внутри бокса и на смотровое окно, чтобы удалить липкий остаток дезинфицирующего средства.

Подготовьте контейнер для отходов для установки в бокс биологической безопасности. Убедитесь, что конечная концентрация раствора дезинфицирующего средства на основе двойных четвертичных аммониевых соединений в контейнере для отходов составляет не менее 5%, с учетом любой добавляемой жидкости. Поместите контейнер с 5% раствором дезинфицирующего средства на основе двойных четвертичных аммониевых соединений внутрь бокса биологической безопасности II класса.

Все манипуляции следует проводить как можно ближе к центру рабочей зоны бокса биологической безопасности II класса. Центральная часть спроектирована таким образом, чтобы обеспечить максимальную защиту оператора. Перенесите 50 µL образца вируса и контрольного вируса в лунки для разведения, содержащие 450 µL модифицированной среды Игла в модификации Дульбекко с 2% фетальной бычьей сыворотки.

Продолжайте выполнять серийные разведения до достижения необходимого диапазона. Перемешивайте образцы вируса не менее пяти раз с помощью дозатора, меняя наконечники после каждого разведения. Перемешивайте медленно, чтобы минимизировать образование пузырьков воздуха в образцах.

По завершении отставьте лунки с разведениями в сторону. При утилизации наконечников промойте каждый из них дезинфицирующим раствором из контейнера для отходов, чтобы обеззаразить внутреннюю и внешнюю поверхности наконечника перед его сбросом в контейнер для отходов. Удалите большую часть среды из лунок 6-луночных планшетов для культивирования клеток.

Внесите по 100 µL соответствующего образца в надлежащие лунки предварительно маркированных планшетов в двух повторностях. По завершении обработки обработайте руки в перчатках дезинфицирующим раствором из распылителя. С помощью бумажного полотенца, смоченного дезинфицирующим раствором, протрите внешнюю сторону всех планшетов, прежде чем вручную поместить их в инкубатор.

Каждые 15 минут в течение одного часа покачивайте планшеты по траектории в виде восьмерки, чтобы обеспечить равномерное распределение образца по клеткам. Добавьте по 2 мл смеси для покрытия в каждую лунку и снова покачайте планшет по траектории в виде восьмерки для равномерного распределения покрытия по всей поверхности лунки. Полностью погрузите все отходы в 5% дезинфицирующий раствор в контейнере для отходов на время экспозиции не менее 10 минут.

Опрыскайте внутреннюю и внешнюю поверхности контейнера для отходов, внутреннюю поверхность бокса биологической безопасности II класса, внешние поверхности оборудования и руки в перчатках 5% раствором дезинфицирующего средства. Оставьте раствор в контейнере для отходов и на других поверхностях на время экспозиции 10 минут. Затем извлеките предметы из бокса биологической безопасности и перенесите их к раковине.

Поместите использованную пипетку в лоток для пипеток для последующего автоклавирования. Вылейте содержимое ведра для отходов через сито в раковину. Затем подставьте к раковине контейнер для биоопасных отходов с красным пакетом для биоопасных отходов и пересыпьте содержимое сита в этот пакет.

Поместите пакет для биоотходов на лоток автоклава на тележке. Неплотно закройте пакеты для автоклавирования лентой, чтобы пар мог проникать внутрь. На одной из лент для автоклавирования укажите свои инициалы и дату.

Извлеките перфорированный металлический стержень из автоклава и откройте крышку. Поместите в металлический стержень ампулу с биологическим индикатором, содержащим споры Geobacillus stearothermophilus, чтобы подтвердить успешное завершение цикла стерилизации в автоклаве. Поместите в автоклав лоток с отходами.

Запустите автоклав и убедитесь, что цикл начался. На рабочем экране автоклава будет отображаться оставшееся время до завершения текущего цикла. По истечении необходимого периода инкубации осторожно извлеките планшеты для анализа бляшек из инкубатора и вручную поместите их в чистый бокс биологической безопасности II класса.

Отосспирируйте среду и материал покрытия с помощью пипетки и перенесите их в контейнер с дезинфицирующим раствором. Замените среду смесью 10% нейтрального буферизованного формалина и 0,8% кристаллического фиолетового для инактивации вируса в течение 30 минут. После инактивации осторожно удалите смесь нейтрального буферизованного формалина и кристаллического фиолетового, поместив ее в отдельный контейнер для отходов для последующей нейтрализации перед утилизацией.

Промойте планшеты под краном, чтобы удалить излишки красителя, а затем поместите их в лоток до полного высыхания. Используйте лайт-бокс для подсчета бляшек. Запишите все результаты подсчета и рассчитайте титры вируса по стандартной формуле.

Для выноса инактивированных образцов из лаборатории BSL-4 поместите пробирки или планшеты в пакет для термосварки. Распылите внутри пакета 5% раствор дезинфицирующего или фиксирующего средства, чтобы продезинфицировать внутреннюю поверхность пакета и внешнюю поверхность пробирок с образцами. После этого герметизируйте пакет с помощью термосварщика.

Поместите этот пакет в другой пакет, следуя той же процедуре. Герметизируйте второй пакет с помощью термозапайки и поместите пакеты с двойным швом в емкость для дезинфекции с 5% раствором дезинфицирующего средства минимум на 10 минут для обеззараживания внешней поверхности пакетов. Заполните журнал учета дезинфекции в лаборатории, указав количество и размер пробирок, объем содержимого пробирок, использованный агент, примененный метод инактивации и помещение, в которое будут перенесены образцы.

Соблюдение надлежащих процедур в лаборатории 4-го уровня биобезопасности имеет решающее значение для обеспечения безопасного и эффективного выполнения анализов. Используя заполненный ежедневный внутренний контрольный список, сотрудники лаборатории убеждаются в полной исправности оборудования. Образец вируса подвергают серийному разведению для получения планшетов, содержащих от 30 до 300 бляшек на лунку, и для определения титра вируса.

На формирование бляшек влияет ряд факторов, включая тропность вируса к клеточным линиям хозяина, технику инокуляции, условия роста вируса, подходящий диапазон разведений и выбор состава агарозного слоя. Отходы, образующиеся в шкафу биологической безопасности во время процедуры, дезинфицируют дважды. Отходы подвергают надлежащей дезинфекции один раз перед их извлечением из шкафа биологической безопасности.

Впоследствии отходы подвергаются автоклавированию перед выносом из зоны работы с животными 4-го уровня биологической безопасности. Благодаря соблюдению этих процедур при проведении исследований с животными 4-го уровня биологической безопасности в Интегрированном исследовательском центре в Фредерике не было зафиксировано ни одного случая лабораторного заражения. При правильном выполнении данной методики процедура занимает от трех до четырех часов в зависимости от количества образцов.

При выполнении данной процедуры помните о необходимости правильного проведения разведений, соответствующего подсчета бляшек и соблюдения всех мер предосторожности для обеспечения безопасности и успеха эксперимента. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о физических ограничениях, накладываемых костюмами с избыточным давлением, а также о дополнительном времени, необходимом для завершения стандартного метода анализа бляшек.