Multi-пропуск экзонов Использование Коктейль антисмысловые олигонуклеотиды в собачьих Х-хромосомой мышечной дистрофии

Общая цель этого эксперимента — изучить эффективность и токсичность множественного пропуска экзонов с использованием коктейльных антисмысловых олигонуклеотидов или AON на собачьей модели мышечной дистрофии Дюшенна или МДД. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в трансляционных исследованиях терапии пропуска антисмысловых экзонов, например, могут ли антисмысловые олигонуклеотиды индуцировать множественный пропуск экзонов и разрушать экспрессию дистрофии в крупной животной модели. Основное преимущество использования модели собаки в исследовании заключается в том, что терапевтические результаты у более крупных животных могут быть более надежно экстраполированы на пациентов с МДД.

Хотя пропуск экзонов является очень перспективной терапией для лечения МДД, он также может применяться при других генетических заболеваниях, таких как врожденная мышечная дистрофия и мышечная дистрофия конечностей и пояса конечностей. Демонстрацию экспериментов in vitro будет проводить доктор Йошицугу Аоки, руководитель нашей лаборатории, а демонстрация экспериментов in vivo будет проводиться доктором Муцуки Кураока, постдокторантом моего отдела. После разработки AON в соответствии с текстовым протоколом используйте 6-луночные планшеты для посева от одного до пяти раз по 10 до трети на квадратный сантиметр CXMD myoblasts в трех миллилитрах DMEM с 10% FBS и 1% пен-стрептококка.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия до конфлюкса от 60 до 80%. Когда клетки достигнут желаемого слияния, используйте восстановленную сывороточную среду для разбавления катионного реагента для трансфекции липосом до общего объема 100 микролитров и дайте смеси постоять при комнатной температуре от 30 до 45 минут. Затем при уменьшенном содержании сыворотки разбавьте АОНы до конечного объема 100 мкл.

Соедините разведенный реагент для трансфекции с разведенными АОНами и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Тем временем удалите среду из клеток и с помощью свежей среды промойте клетки три раза. Далее в трансфекционную смесь добавляют 0,8 миллилитра среды, а затем добавляют весь раствор в только что вымытые клетки.

Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем добавьте в клетки среду для дифференцировки (СД) и инкубируйте до 10 дней, чтобы произошла дифференцировка. Начиная примерно с третьего дня, проверьте дифференциацию.

Чтобы выполнить морфолинотрансфекцию миобластов собак, культивируйте миобласты CXMD, как было показано ранее в этом видео. Нагрейте коктейль морфолинос при температуре 65 градусов Цельсия в течение 10 минут. Затем добавьте реагент для доставки пептидов и отрегулируйте морфолино до конечной концентрации от трех до шести микромоляров.

Затем используйте ДМ для замены среды в миобластах и добавьте морфолино в каждую лунку в конечной концентрации одного микромоляра. Выдерживать от 16 до 18 часов. Затем, чтобы собрать клетки для экстракции РНК, добавьте один миллилитр тиоцианата-фенол-хлороформа гуанидиния в клетки, чтобы отсоединить их от пластины.

После инкубации клеток при комнатной температуре в течение 10 минут переложите клетки в 1,5-миллилитровые пробирки. Добавьте 200 микролитров хлороформа в каждую пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение двух минут, пока не станут видны три отдельных слоя: слой РНК, слой белка и слой ДНК. Центрифугируйте в пробирках при 12 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Затем снимите верхний слой надосадочной жидкости и переложите в пробирку, содержащую 500 микролитров изопропанола. Закрутите надосадочную жидкость трубки перед удалением надосадочной жидкости и сохранением гранулы РНК. Используйте этанол для промывки гранул и центрифугируйте при температуре 8 000 раз g и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Переверните трубку на 15 минут, чтобы испарить остаточный этанол, прежде чем добавить от 15 до 30 микролитров воды, не содержащей РНКазы. Затем используйте УФ-ВИД спектроскопию на 260 нанометрах для количественного определения РНК. Чтобы провести ОТ-ПЦР, смешайте вместе следующие реагенты и добавьте воду до конечного объема 25 микролитров.

Поместите образцы в амплификатор и запустите следующую программу. Когда тираж будет завершен, храните продукт при температуре четыре градуса Цельсия или 20 градусов Цельсия. Чтобы провести внутримышечную инъекцию, после подготовки животного к операции и обезболивания его согласно текстовому протоколу, с помощью скальпеля надрезать кожу примерно на пять сантиметров в продольном направлении над черепно-большеберцовой костью, или CT.To отметить места инъекций, с помощью хирургической иглы и хирургической нити зашить глубокую фасцию, сделав два маркера стежков с интервалом в два сантиметра.

Очень важно пометить место инъекции нитью, так как это позволяет провести более точную биопсию. Затем с помощью иглы 27 калибра введите желаемую концентрацию AON в мышцу и оставьте иглу на одну минуту. Затем, чтобы выполнить открытую биопсию мышцы, с помощью хирургического скальпеля удалить кусочек мышечной ткани длиной примерно два сантиметра из КТ-мышцы.

Положите мышечную фасцию обратно на мышцу и с помощью рассасывающейся нити закройте ткань. Затем используйте нейлоновую нить 000, чтобы закрыть кожу. С помощью иглы введите внутримышечную инъекцию 0,02 миллиграмма на килограмм гидрохлорида бупренорфина.

Чтобы ввести коктейль, содержащий равное количество каждого АОН, в вену конечности, удерживая животное согласно текстовому протоколу, введите в вену конечности венозную индейскую иглу. С помощью инфузионного насоса или шприца-водителя вводите в общей сложности 50 миллилитров со скоростью 2,5 миллилитров в минуту в течение 20 минут, следуя инструкциям производителя. Повторяйте инъекции еженедельно или раз в две недели, так как при повторных инъекциях экспрессия дистрофина будет накапливаться.

Чтобы выполнить еженедельные анализы крови для исследования токсичности, с помощью иглы собирают три миллилитра крови из одной из подкожных вен передней или задней конечности. Следуя инструкциям производителя, включите следующие оценки. Проведите дальнейшие анализы в соответствии с текстовым протоколом.

Миобласты трансфицировали с различными условиями лечения 2'OMePS с целью сравнения эффективности каждого AON. Показанный здесь гель представляет собой образцы ОТ-ПЦР из РНК, собранные через четыре дня после лечения. Полосы выше на геле представляют внерамочные продукты DMD и были замечены в необработанных миобластах, обработанных Ex8A и Ex8B.

Ex6A, Ex6B, Ex8A и обработанные коктейлем миобласты показали продукты в кадре. Секвенирование кДНК подтвердило, что экзон с 6 по 9 был пропущен. Как видно на этом рисунке, иммуноцитохимия показала, что клетки собак, обработанные AON, имели повышенное количество дистрофин-положительных волокон по сравнению с необработанными образцами.

Чтобы сравнить эффективность различных состояний лечения AON, собакам с CXMD вводили Ex6A или коктейль из Ex6A, Ex6B и Ex8A в различных дозировках. Образцы мышц, окрашенных на DYS1, показывают увеличение экспрессии дистрофина в образцах, обработанных коктейлем, а дистрофин-положительные волокна увеличивались с дозировкой дистрофина. После системных инъекций у собак, получавших коктейль из CXMD, наблюдалась повышенная экспрессия дистрофина по сравнению с собаками с NT CXMD, как в образцах КТ, так и в образцах сердечной мышцы.

Тем не менее, скелетные мышцы, обработанные AON, показали гораздо более высокую экспрессию дистрофина по сравнению с обработанной сердечной мышцей. Кроме того, у собак, получавших лечение CXMD, наблюдалась улучшенная гистопатология со значительным уменьшением волокон с центральным ядром по сравнению с собаками NT CXMD. После освоения эксперименты как in vitro, так и in vivo можно провести за пару часов, если они выполнены правильно.

Во время этой процедуры важно внимательно следить за состоянием здоровья собаки. После своего развития системный пропуск экзонов проложил путь исследователям в этой области к началу клинических испытаний на людях у пациентов с МДД. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как лечить собак антисмысловыми олигонуклеотидами.