Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Общая цель данной процедуры клонирования и трансформации заключается в эффективном создании векторов CRISPR и получении мутантных корней томатов с нокаутом генов, которые могут быть использованы в функциональных геномных исследованиях. Этот метод является полезным инструментом в области геномики растений, так как он позволяет создавать большое количество нокаутных мутантов для изучения различных процессов в корнях. Основным преимуществом данной методики является то, что процедура клонирования может быть выполнена в один этап, что позволяет получить необходимые материалы всего за несколько недель.

Сначала сконструируйте олигонуклеотиды гидовой РНК или гРНК, которые включают фрагмент GN19 целевых мотивов, фланкированный последовательностями по 20 нуклеотидов с 5'- и 3'-концов, необходимыми для сборки ДНК. Проведите рестрикцию от 1 до 5 µg плазмиды P201N caznine с помощью рестриктазы Spe1 при 37 °C в течение двух часов. После очистки продуктов рестрикции на колонке согласно инструкциям производителя, ресуспендируйте образец в 15 µL 10 mM Trs HCL.

Количественно определите содержание ДНК с помощью УФ-спектрофотометрии. Проведите второе расщепление с использованием рестриктазы Swa1 при 25 °C в течение двух часов. Проанализируйте 100–200 нг на 0,8% агарозном геле, чтобы подтвердить полноту расщепления.

Правильно рестригированная плазмида будет иметь одну полосу на уровне 14 313 пар оснований. Для ПЦР-амплификации medicago truncatula используйте шесть промоторов и последовательностей скаффолда ДНК из челночной плазмиды puck gRNA. Используйте праймеры Swa1, Mtu6F и MTU6R, а также scaffold F в Spe1 и scaffold R с использованием высокоточной полимеразы.

Проведите электрофорез трех микролитровых аликвот продуктов ПЦР в 1% агарозном геле для подтверждения амплификации. Размер ампликона MTU6 составляет 377 пар оснований, а ампликона скаффолда — 106 пар оснований. Очистите оставшиеся продукты ПЦР с помощью колоночной очистки согласно инструкциям производителя.

Проведите количественное определение методом УФ-спектрофотометрии, как описано ранее, и храните при температуре -20 °C. Затем ресуспендируйте всё содержимое пробирки с олигонуклеотидами gRNA до концентрации 100 µM в воде лабораторного класса. Добавьте 1 µL олигонуклеотидов к 500 µL 1x буфера NEB 2.1 и тщательно перемешайте.

Запрограммируйте амплификатор с подогреваемой крышкой на поддержание температуры 50 °C. Смешайте 100 ng линеаризованного вектора, 50 ng промотора MtU6, 12 ng скаффолда и 1 µL разведенного олигонуклеотида gRNA в воде до конечного объема 5 µL. Добавьте 5 µL 2X high fidelity DNA Assembly Mastermix.

Тщательно перемешайте и центрифугируйте для осаждения. Инкубируйте реакционную смесь в течение 60 минут в термоциклере при 50 °C. По истечении часа при 50 °C поместите пробирку со смесью на лед, затем используйте 2 µL для трансформации компетентных клеток E.Coli стандартными методами.

Высейте результат трансформации на LB-агар с добавлением 50 mg/mL канамицина и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Проведите скрининг колоний с помощью ПЦР с использованием праймеров StUb3p 218R и 1Sce1R. Разведите часть оставшейся смеси для сборки ДНК водой в соотношении 1:5 и используйте 1 µL в качестве положительного контроля для скрининга колоний.

Также добавьте один нанограмм кольцевой плазмиды P201N casnine в качестве отрицательного контроля (без вставки). После ПЦР-амплификации с использованием параметров, указанных в текстовой части протокола, визуализируйте продукт ПЦР на одном процентомном агарозном геле. Правильные вставки характеризуются полосой в 725 пар оснований, а векторы без вставок — полосой в 310 пар оснований.

Культивируйте положительные колонии в жидкой среде LB Can50 в течение ночи при 37 °C. На следующий день очистите плазмиды с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с инструкциями производителя. После секвенирования по Сэнгеру очищенных плазмид с использованием праймера StuB3P218R сопоставьте хроматограммы с последовательностями промотора MtU6, Target и скаффолда, чтобы убедиться в отсутствии ошибок, внесенных в процессе клонирования.

Выполните диагностическое рестрикционное расщепление, обработав 1 µg плазмиды ферментами EcoR5 и Sti1. При визуализации на 0,8% агарозном геле должен наблюдаться данный паттерн полос. Наконец, трансформируйте плазмиды в штамм Agrobacterium rhizogenes ARqua1, добавив 1 µL препарата плазмиды к 50 µL электрокомпетентных клеток и проведя электропорацию в кювете шириной 1 mm.

Добавьте примерно 500 µL среды SOC и инкубируйте при перемешивании при 28 °C в течение двух часов. Затем высейте культуру на чашки с LB Can50 и выращивайте при 28 °C в течение двух дней. Начните данный этап процедуры со стерилизации семян томата в 20 % растворе бытового отбеливателя в течение 15 минут при постоянном перемешивании.

Затем перенесите семена в ламинарный шкаф. Удалите остатки отбеливателя и трижды промойте семена стерильной лабораторной водой. Посейте 30 семян в бокс GA7 с половинной концентрацией среды MS.

Оставьте для прорастания примерно на два дня в темноте. После прорастания семян перенесите боксы GA7 на свет. За день до трансформации высейте культуры A.rhizogenes на твердый LB с добавлением Can50 и инкубируйте при 28 °C в течение ночи. В день трансформации, работая в ламинарном шкафу, добавьте 25 µL ацетосирингона к 50 mL среды MS половинной концентрации и разлейте по 6 mL в каждую пробирку с культурой.

Используйте изогнутый наконечник на 200 µL, чтобы собрать клетки A.rhizogenes с чашки, и ресуспендируйте их в 6 mL жидкой среды MS половинной концентрации. Перемешайте пробирку на вортексе до полного ресуспендирования клеток. После ресуспендирования клеток для каждого вектора возьмите 1 mL суспензии и измерьте оптическую плотность при фиксированной длине волны 600 nm.

Добавьте два миллилитра жидкой среды MS половинной концентрации в чашку Петри со стерильной фильтровальной бумагой. Вырежьте семядоли из проростков и поместите их на увлажненную фильтровальную бумагу. После сбора всех семядолей отрежьте один сантиметр от дистального конца каждой семядоли, чтобы получить фрагменты семядолей с двумя срезами.

Перенесите экспланты в растворы A.rhizogenes и перемешайте. Инкубируйте в течение 20 минут, периодически переворачивая пробирки. Во время инкубации с A.rhizogenes поместите кусочек фильтровальной бумаги в чашку Петри для каждого трансформируемого конструкта.

Также поместите в ламинарный шкаф одну порцию твердой среды MS половинной концентрации без антибиотиков для просушки. С помощью стерильного пинцета извлеките семядоли из раствора A.rhizogenes и перенесите их на сухую фильтровальную бумагу. Накройте крышкой чашки Петри, чтобы ткани не пересохли во время подготовки к следующей трансформации.

Затем промокните семядоли фильтровальной бумагой и перенесите их абаксиальной стороной вверх на среду 1/2 MS. Оберните чашки хирургическим пластырем и проведите кокультивацию в темноте при комнатной температуре в течение двух дней. После кокультивации перенесите семядоли абаксиальной стороной вверх на дополненную среду 1/2 MS.

Оберните хирургическим пластырем. Культуры следует содержать под флуоресцентными лампами при комнатной температуре с 16-часовым фотопериодом. Через 1,5–2 недели с помощью стерильного пинцета и скальпеля вырежьте корни длиной не менее двух сантиметров из семядолей и перенесите их на среду 1/2 MS, дополненную тикарциллоном/клавулановой кислотой и канамицином.

Перенесите от десяти до 15 корней на одну чашку. Отметьте положение кончиков корней маркером. Оберните хирургическим пластырем и поместите в помещение для культивирования.

Через одну неделю на селективной среде наблюдается рост трансформированных корней. Соберите часть трансформированных корней для экстракции ДНК, используя предпочтительный метод выделения ДНК. Появление волосатых корней из семядолей можно наблюдать через 11 дней после трансформации.

Корни отбирают на половине среды MS с добавлением тикарциллона/клавулановой кислоты и канамицина в течение примерно одной недели. Серыми полосами отмечено положение кончиков корней на момент высева. Это пример клонирования и секвенирования продуктов ПЦР для определения мутаций ДНК по двум различным генным мишеням в четырех разных линиях волосатых корней.

Серым цветом выделена целевая последовательность GN20 GG, а символ delta указывает на тип мутации. Количество клонов с указанной мутацией приведено справа. Это пример полиакриламидного геля для определения мутаций ДНК.

Крупные делеции и полосы гетеродуплексов указывают на наличие мутаций ДНК в целевых последовательностях. Шесть из 12 независимых событий были классифицированы как мутантные, что отмечено символом дельта. WT обозначает контроль дикого типа, а NT — контроль без матрицы.

После освоения метода за одну неделю можно создать от десятков до сотен векторов CRISPR, а материалы группы trendulate получить за несколько недель. При выполнении данной процедуры важно удалить и подавить рост любых остаточных клеток Agrobacterium. Избыточный рост Agrobacterium будет подавлять развитие корневого материала и приведет к его гибели.

После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как создавать векторы CRISPR с помощью сборки ДНК, а также как тестировать эти векторы, используя модель волосатых корней и томаты.