ЖХ-МС анализ тромбоцитами человека как платформа для изучения метаболизма митохондрий
4 апреля 2016 г.
Здесь мы показываем , изолированные человеческие тромбоциты могут быть использованы в качестве доступной ех естественных условиях модель для изучения метаболических адаптации в ответ на комплекс I ингибитор ротенон. Этот подход использует изотопный отслеживанию и относительную количественную оценку с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии, и может быть применен к различным дизайнов исследований.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить, как лечение ксенобиотиками или состояние заболевания изменяют клеточный метаболизм. Этот метод обладает потенциалом для выявления того, как состояние заболевания или применяемый токсин влияют на клеточный метаболизм. И как только это станет известно, наш метод сможет выявить, может ли какое-либо вмешательство исправить дефект.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что он не полагается на трансформированные клеточные линии, поэтому он с большей вероятностью даст ответы, которые имеют непосредственное отношение к здоровью человека. Для начала этой процедуры готовят 10 миллимолярный стоковый раствор ротенона в диметилсульфоксиде. Проводите последовательное разведение стокового раствора 10 миллимоляров ротенона для получения растворов с концентрацией ротенона в диапазоне от одного наномоляра до 100 микромоляров.
Затем добавьте по 50 микролитров каждого стокового раствора к пяти миллилитрам ранее приготовленного обогащенного буферного раствора Тайроде для приготовления растворов с концентрацией ротенона в диапазоне от 10 пикомоляров до одного микромоляра. Добавьте 50 микролитров ДМСО в один из образцов буферного раствора, который будет использоваться в качестве средства управления транспортным средством. Чтобы выделить тромбоциты из цельной крови, центрифугируйте образцы цельной крови при давлении 175 x g в течение 15 минут без перерывов.
Когда закончите, перенесите один миллилитр верхнего слоя обогащенной тромбоцитами плазмы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. При переносе обогащенной тромбоцитами плазмы будьте осторожны, чтобы не нарушить охристую оболочку, чтобы тромбоцитарная гранула не была загрязнена лимфоцитами. Центрифугируйте обогащенный тромбоцитами слой плазмы при давлении 400 x g в течение пяти минут.
Затем аспирируйте надосадочную жидкость. Используя не менее трех биологических репликатов для каждого состояния, ресуспендируйте тромбоцитарную гранулу в одном миллилитре каждого ранее приготовленного раствора ротенона. После этого инкубируйте ресуспендированные тромбоциты в инкубаторе с водяной рубашкой, настроенном на влажность 95% и 5% углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.
На этом этапе гранулируйте тромбоциты, центрифугируя образцы при 3000 x g в течение трех минут. После аспирации надосадочной жидкости добавьте соответствующий внутренний стандарт, меченный стабильными изотопами. Затем ресуспендируйте тромбоциты в 750 микролитрах ледяной 10% трихлоруксусной кислоты.
Импульсная обработка каждого образца ультразвуком 30 раз с импульсами 0,5 секунды. После центрифугирования прикрепите твердофазные экстракционные колонки C18 к вакуумному коллектору. Кондиционируйте колонки одним миллилитром метанола.
Затем уравновесьте колонны одним миллилитром дважды дистиллированной воды. Прогоните супертантант, полученный из образца, по столбцам. Когда закончите, промойте колонны одним миллилитром воды.
Затем загрузите стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 миллилитров в вакуумный коллектор для сбора фракций элюирования. Разбавьте колонки одним миллилитром 25 миллимолярного ацетата аммония и метанола. После сушки элюата под действием газообразного азота суспендировать высушенные остатки в 50 микролитрах 5%-5-сульфосалициловой кислоты и перенести образцы в файлы ВЭЖХ для анализа.
Как сообщалось ранее в клетках SH-SY5Y, предполагается, что изменения относительных уровней тиоэфиров ацеил-КоА в ответ на ротенон могут быть результатом ингибирования комплекса. В частности, наблюдается дозозависимое снижение сукцинилКоА с одновременным повышением бета-гидроксибутирил-КоА, при этом уровни ацетилКоА оставались неизменными. Анализ тромбоцитов человека, обработанных ротеноном, дает весьма стабильные результаты и предоставляет уникальный набор экспериментальных данных.
Важно отметить, что это наблюдение подчеркивает митохондриальную зависимость ответа на ротенон, поскольку у тромбоцитов отсутствуют ядра. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как метаболическое отслеживание, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: Как это лечение или состояние заболевания влияет на использование субстрата? Если мы выявляем изменения в уровнях какого-то метаболита, то почему он меняется?
Какие этапы пути затрагиваются и каким образом? После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделять тромбоциты из цельной крови, выполнять контролируемую провокацию ex-vivo и извлекать тиоэфиры ацеил-КоА для анализа LCMS.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании демонстрируется использование изолированных тромбоцитов человека в качестве модели ex vivo для изучения метаболических адаптаций в ответ на воздействие ротенона — ингибитора комплекса I. Метод основан на изотопном трейсинге и жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии для относительного количественного анализа, что позволяет применять его в различных схемах исследований.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточный метаболизм
- Фармакология
- Значимость для здоровья человека
Введение
- Понимание того, как ксенобиотики влияют на клеточный метаболизм, имеет решающее значение.
- Изолированные тромбоциты человека представляют собой более подходящую модель по сравнению с трансформированными клеточными линиями.
- Данный подход может помочь в поиске потенциальных способов коррекции метаболических дефектов.
- Ротеннон используется в качестве ингибитора комплекса I для изучения метаболических изменений.
Цель исследования
- Определить влияние воздействия ксенобиотиков на клеточный метаболизм.
- Изучить, как патологические состояния изменяют метаболические процессы.
- Оценить возможность применения терапевтических вмешательств для коррекции метаболических дефектов.
Используемые методы
- Приготовление 10 миллимолярного стокового раствора ротенона в диметилсульфоксиде.
- Последовательное разведение стокового раствора ротенона для получения различных концентраций.
- Изотопное мечение для метаболического анализа.
- Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия для количественного определения.
Основные результаты
- Изолированные тромбоциты эффективно моделируют метаболические ответы на воздействие ротенона.
- Изотопное мечение выявляет значительные метаболические адаптации.
- Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия обеспечивает точный количественный анализ.
- Данный метод применим к различным вариантам дизайна экспериментов.
Выводы
- Изолированные тромбоциты человека являются ценной моделью для изучения метаболизма.
- Данный подход может способствовать пониманию механизмов заболеваний и разработке потенциальных методов терапии.
- В будущих исследованиях этот метод можно будет расширить для изучения других метаболических путей.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Тромбоциты человека представляют собой клинически значимую, не трансформированную модель для изучения митохондриального метаболизма и воздействия ксенобиотиков, что позволяет преодолеть ограничения, присущие линиям раковых клеток в метаболических исследованиях. Данная платформа обеспечивает воспроизводимый, донор-специфичный анализ изменений метаболических путей, поддерживая валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах поиска. Возможность масштабирования за счет использования ресурсов банков крови способствует трансляционной преемственности от фундаментальных открытий к доклиническим и клиническим исследованиям.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, исследуя митохондриальные ответы на ингибиторы комплекса I, такие как ротенон.
- Практическая ценность: предоставляет релевантную для человека систему, которая снижает влияние искажающих переменных, вызванных метаболическим перепрограммированием в трансформированных клеточных линиях.
- Прогностическая ценность: способствует биологическому снижению рисков за счет стабильного выявления компенсаторных метаболических сдвигов, таких как усиление окисления жирных кислот при ингибировании гликолиза.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные ЖХ-МС о тиоэфирах ацил-CoA, что обеспечивает возможность относительного количественного определения и изотопного мечения для оценки активности специфических путей метаболизма.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимые метаболомные профили в биологических повторах, что способствует стандартизации анализа для кампаний по скринингу ксенобиотиков.
- Масштабируемость: изоляция тромбоцитов от отдельных доноров или из банков крови позволяет масштабировать получение метаболически активных образцов для высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связывает реакции тромбоцитов ex vivo с метаболическими адаптациями in vivo, обеспечивая доклиническую валидацию, согласованную с биомаркерами.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет определить, зависят ли наблюдаемые метаболические изменения от митохондрий, что подтверждается реакциями безъядерных тромбоцитов.
- Продвижение с учетом рисков: Позволяет оценить эффективность вмешательства в устранении метаболических дефектов, что служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при оптимизации ведущих соединений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической оценки, в особенности для соединений, нацеленных на митохондрии, и метаболических модуляторов.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о влиянии ксенобиотиков на клеточный метаболизм путем изоляции ответов тромбоцитов на дозозависимое воздействие ротенона.
- Скрининг: Позволяет подготавливать тромбоциты к анализу методом ЖХ-МС, обеспечивая воспроизводимые количественные результаты для скрининга библиотек соединений.
- Аналитика: Обеспечивает относительное количественное определение тиоэфиров ацетил-CoA, сукцинил-CoA и бета-гидроксибутирил-CoA, что позволяет сравнивать метаболические потоки при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Соответствует принципам преклинической преемственности путем моделирования метаболических адаптаций, имеющих значение для патологических состояний и терапевтических вмешательств.
- Корпоративное повторное использование: Создает стандартизированный рабочий процесс изоляции тромбоцитов и экстракции метаболитов, применимый в нескольких проектах и терапевтических областях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет использования физиологически релевантной модели человека, позволяющей избежать артефактов, характерных для линий раковых клеток.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным протоколам изоляции тромбоцитов, воздействия ex vivo и экстракции метаболитов.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая раннее выявление метаболических рисков, что снижает процент неудач на поздних стадиях из-за непредвиденной митохондриальной токсичности.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию соединений с учетом рисков на основе их воздействия на основные метаболические пути в релевантной системе человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения тромбоцитов, стерильной работы с клетками и метаболомики методом LC-MS/MS.
- Зависимость от наличия центрифугирующего оборудования, вакуумных манифольдов для твердофазной экстракции и систем HPLC-MS.
- Необходима стандартизация подготовки богатой тромбоцитами плазмы и дозирования ротенона между лабораториями и донорами.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных ксенобиотиков и схем изотопного мечения.
- Ограничено жизнеспособностью тромбоцитов ex vivo и необходимостью немедленной обработки после выделения для сохранения метаболической целостности.
