Полный рабочий процесс для анализа гистонов посттрансляционные модификации Использование снизу вверх Масс-спектрометрия: От Гистона добычи до анализа данных

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить простую процедуру для оценки относительного содержания гистонов после трансляции, которые играют важную роль в биологии хроматина, такие как регуляция экспрессии генов и конденсация хромосом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии хроматина. Например, какие модификации гистонов изменяют их относительную распространенность при стимуляции или лечении данных клеток или тканей.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что, используя протеомику, основанную на масс-спектрометрии, мы можем одновременно количественно оценить большинство известных ПТМ на известных белках в одном анализе. Анализ модификации гистонов имеет множество применений, включая оценку эпигенетических изменений и работы хроматина у индивидуумов или модельной системы при медикаментозном лечении или стрессе. Помимо Симоны, два других сотрудника моей лаборатории продемонстрируют процедуры этого протокола.

Натараджан Бхану, специалист по исследованиям, и Келли Карч, аспирантка. Как показано в этом рабочем процессе, это 10-этапный протокол, который включает в себя очистку гистонов из клеточных культур или тканей, дериватизацию гистонов, разложение и обессоливание, а также масс-спектрометрический анализ с использованием нанопроточной жидкостной хроматографии. В этом видео будут продемонстрированы только некоторые процедуры.

Чтобы начать процедуру выделения ядер из интактных клеток, разморозьте на льду клетки, которые ранее были собраны и хранились при температуре минус 80 градусов Цельсия. И подготовить ядерный изоляционный буфер, или NIB, как описано в тексте протокола. Удалите одну пятую объема NIB и добавьте NP-40 Alternative до конечной концентрации 0,2%. Оставшиеся четыре пятых объема будут использоваться для стирки.

Промойте клеточную гранулу NIB без NP-40 Alternative, используя соотношение объема клеточной гранулы к буферному объему 1:10. Центрифугируйте при 700 RCF в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость. Лизируйте клеточную гранулу, поместив ее на лед и добавив NIB с 0,2% NP-40 Alternative в соотношении 1:10 объема клеточных гранул к буферному объему.

Гомогенизируйте клетки с помощью щадящего пипетирования. Инкубируйте гомогенизированные клетки на льду в течение 5-10 минут, чтобы клетки лизировались и высвобождали ядра. Центрифугируйте при 1000 RCF в течение пяти-10 минут при четырех градусах Цельсия.

Гранула будет содержать в основном ядра клеток, в то время как надосадочная жидкость будет содержать в основном цитоплазматические компоненты. При желании сохраните цитоплазматическую фракцию. Промойте гранулы ядер, аккуратно повторно суспендируя их NIB без альтернативы NP-40, используя соотношение объема гранул к объему буфера 1:10.

Центрифугируйте при 1000 RCF в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалите надосадочную жидкость. После того, как NP-40 Alternative будет полностью удален из гранул ядер, добавьте ледяную 0,2 молярную серную кислоту в соотношении объема ядер к объему серной кислоты 1:5. Повторно суспендируйте ядра в серной кислоте с помощью щадящего пипетирования.

Инкубируйте образец при постоянном вращении или осторожном встряхивании в течение двух-четырех часов при температуре четыре градуса Цельсия. Затем центрифугируйте образец при температуре 3400 RCF при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. Снова центрифугируйте и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку, чтобы удалить любой нерастворимый материал.

Чтобы осаждать гистоны, добавьте охлажденную 100% трихлоруксусную кислоту, или ТСА, в собранный надосадочный слой в соотношении 1:3 по объему. О наличии гистонов свидетельствует помутнение образца. Перемешайте, несколько раз перевернув трубку.

Выдержите смесь на льду не менее одного часа. Центрифугируйте при 3400 RCF в течение пяти минут. После центрифугирования гистоны покроют боковые стороны пробирки, а также остановятся на дне.

На самом дне пробирки также образуется белая нерастворимая гранула, которая в основном содержит негистоновые белки и другие биомолекулы. Осторожно удалите надосадочную жидкость путем аспирации, не соскребая стенки пробирки, или гранулу на дне пробирки. Используя стеклянную пипетку Пастера, промойте пробирку 100% ледяным ацетоном плюс 0,1% соляной кислотой, чтобы покрыть осажденные белки, покрывающие боковые стороны и дно.

Центрифугируйте при 3400 RCF в течение двух минут. Отсасывайте надосадочную жидкость осторожно, не соскребая бока или гранулы. Промойте пробирку 100% ледяным ацетоном, снова центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, не соскребая стенки или гранулы.

Затем проводится количественное определение гистонов и анализ чистоты, как описано в тексте протокола. Перед дериватизацией гистонов также может быть выполнено необязательное фракционирование вариантов гистонов с помощью ВЭЖХ с обратной фазой. Начните эту процедуру с растворения образцов гистонов в 40 микролитрах 50 миллимолярного бикарбоната аммония, pH 8,0.

Проверьте pH, вставив наконечник пипетки P10 в образец без аспирации и прикоснувшись наконечником пипетки к полоске индикатора pH. Используйте гидроксид аммония и муравьиную кислоту для регулировки pH до 8,0. С этого момента все шаги, связанные с использованием пропионового ангидрида, должны выполняться в вытяжном шкафу.

Обрабатывайте не более трех-четырех образцов за один раз, чтобы поддерживать реакционную способность пропионового ангидрида. Приготовьте свежий реагент для пропионилирования, смешав пропионовый ангидрид с ацетонитрилом в объемном соотношении 1:3. Добавьте реагент для пропионилирования в каждый образец в объемном соотношении 1:4.

Быстро добавьте гидроксид аммония, чтобы восстановить pH 8,0 в растворе. Обычно добавление гидроксида аммония в образец с объемным соотношением 1:5 целесообразно для восстановления pH 8,0. Немедленно перемешайте вортексом.

Проверьте pH. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 15 минут. После того, как все образцы прошли пропионилирование, высушите образцы до 10-20 микролитров в вакуумном концентраторе.

Повторно суспендируйте или разбавьте образцы ddH20 до тех пор, пока не будет достигнуто 40 микролитров конечного объема. Поскольку соли препятствуют жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, образцы должны быть обессолены перед анализом. Для целей этого видео будет продемонстрирована только конструкция сценических наконечников.

Используйте наконечник для дозатора P1000 для пробивания диска с материалом C18 из твердофазного диска для экстракции. С помощью капилляра из плавленого диоксида кремния вытолкните мини-диск из наконечника P1000 в нижнюю часть наконечника пипетки P100 или P200. Убедитесь, что диск надежно заклинен в нижней части наконечника.

При обессоливании более 25 микрограммов образца используйте два мини-диска C18 в одном наконечнике P100 или P200. Используйте адаптер для центрифуги, чтобы удерживать наконечники ступеней на месте в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 или два миллилитровых. Промойте смолу путем отжима 50 микролитрами 100% ацетонитрила, чтобы активировать материал C18 и удалить потенциальные загрязнения.

Затем проводится обессоливание образца в соответствии с текстом протокола. Пептиды гистонов присутствуют в различных изобарических формах. Приведены два примера, которые обычно широко используются при анализе гистонов.

Выделенная ионная хроматограмма их прекурсорной массы и относительных изотопов, показанная выше, идентична. Тем не менее, экстрагированная ионная хроматограмма ионов продукта, показанная ниже, позволяет различать две изобарические формы. Для оценки относительной численности двух видов следует использовать только уникальные ионы фрагментов, выделенные красным цветом.

Были проанализированы гистоны, извлеченные из эмбриональных стволовых клеток человека, со стимуляцией ретиноевой кислотой и без нее. Относительное количественное определение двух гистоновых пептидов H3 выявило явное снижение ацетилирования в эмбриональных стволовых клетках человека, стимулированное к дифференцировке. Это согласуется с предыдущими сообщениями о более высоком ацетилировании в эмбриональных стволовых клетках по сравнению с дифференцировочными клетками.

После освоения этой техники ее можно выполнить за три дня при правильном выполнении. Один день для экстракции гистонов, второй день для дериватизации и расщепления белка и третий день для дериватизации пептидов, определения стадии и анализа LC-MS. Очистка гистонов может быть использована для других целей, отличных от анализа пептидов, включая протеомику среднего и нисходящего уровня, где можно охарактеризовать комбинаторные модификации гистонов.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как идентифицировать и количественно оценить посттрансляционную модификацию гистонов с помощью протеомики, основанной на масс-спектрометрии.