Антитела к специфическому связыванию Каппа (Vκ) легкой цепи, содержащей человека (IgM) Антитела: полисиаловая кислота (PSA) Прикрепленный к NCAM как Case Study

Общей целью этой процедуры является идентификация антигенов антител с терапевтическим потенциалом с акцентом на изотип IgM. Этот метод заполняет пробел в знаниях в области биомедицины и может помочь идентифицировать новые биомаркеры и иммунотерапевтические агенты для исследований рака и заболеваний центральной нервной системы. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она открывает дверь к запущенному классу антител с большим терапевтическим потенциалом.

Применение этого метода распространяется на диагностику и лечение всех заболеваний, на которые можно нацелиться с помощью терапии на основе антител. Что это может дать представление об антигенах антител IgM, а также о растущих тканях и субкультурах. Он также может поражать другие изотипы антител от всех видов.

Впервые идея этого метода пришла мне в голову, когда я осознал специфическое и заметное связывание антитела IgM в различных биохимических приложениях. Демонстрировать процедуру будут Роберт Кахуд и Йенс Ватцлавик. Чтобы начать эту процедуру, сделайте надрез на черепе спереди на уровне уха и отклейте череп назад.

Затем аккуратно поместите мозг в 15-миллилитровую пробирку и сразу же храните его на сухом льду. Через пять минут переложите мозг на чистую бумагу для взвешивания и быстро удалите мозжечок и ствол мозга с помощью чистого лезвия бритвы. Затем взвесьте замороженный мозг перед тем, как перенести его обратно в 15-миллилитровую пробирку со льдом.

Добавьте ледяной буфер для лизиса до конечной концентрации 150 мкг мозговой ткани на микролитр буфера для лизиса. Затем гомогенизируйте мозг в буфере для лизиса путем растирания с помощью наконечника пипетки объемом в один миллилитр с последующим растиранием через пятимиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра. После этого инкубируйте лизат мозга еще 30 минут на льду, чтобы обеспечить полный лизис тканей.

Через 30 минут удалите моющее средство, нерастворимый материал и липиды мозга для серийного центрифугирования. Выбросьте миелин и клеточный мусор, содержащий гранулы, но сохраняйте надосадочную жидкость после каждого этапа центрифугирования. Аликвотируйте лизат мозга и храните при температуре 80 градусов Цельсия.

На этом шаге подготовьте 200 миллилитров IP Buffer с BSA и еще 200 миллилитров IP Buffer без BSA. Для реакции иммунопреципитации перелейте 100 микролитров агарозной суспензии протеина L в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в пробирку один миллилитр буфера IP с BSA.

Затем перемешайте вручную методом инверсии. Далее промыть шарики агарозы Protein L четыре раза центрифугированием. После этого удалите надосадочную жидкость, не потревожив агарозную гранулу и повторите процедуру промывания еще три раза.

Затем добавьте свежий BSA, содержащий буфер IP, к протеину L и инкубируйте его в течение ночи на валике при температуре четыре градуса Цельсия. В 800 микролитров IP-буфера, содержащего BSA и 30 миллиграммов лизированной мозговой ткани, добавьте 20 микрограммов экспериментального антитела, контрольного антитела или PBS. Инкубируйте 30 миллиграммов лизированной мозговой ткани в ледяном буфере IP с антителами IgM в 1,5-миллиметровой микроцентрифужной пробирке в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день раскрутите шарики агарозы с протеином L в настольной центрифуге. Выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив агарозную гранулу. Затем добавьте охлажденный раствор лизата мозга антител к протеину L-агарозе.

Инкубируйте антиген антитела, суспензию протеина L, в течение двух часов на валике при четырех градусах Цельсия. Через два часа промойте антигенный комплекс антител, присоединенный к агарозе L, через центрифугирование. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и добавьте в нее один миллилитр ледяного буфера IP, содержащего 0,2% БСА.

Повторите этап промывки еще один раз, используя ледяной буфер IP, содержащий 0,2% BSA, и еще два раза, используя ледяной буфер IP без BSA. После этого раскрутите антигенный комплекс антител, присоединенный к агарозе L. Используйте пипетку объемом 200 микролитров, чтобы выбросить надосадочную жидкость, пока примерно 50 микролитров раствора не останется сверху поверх агарозной гранулы белка L. Затем с помощью пипетки объемом 10 микролитров полностью удалите его.

Храните все образцы на льду. Затем добавьте 40 микролитров буфера для элюирования IP в каждую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Пальцем прокрутите трубку шесть раз и нагревайте ее в течение пяти минут при температуре 95 градусов Цельсия.

После этого поместите образец на лед на две минуты и раскрутите его в течение 30 секунд. Затем перелейте 35 микролитров надосадочной жидкости в свежую микроцентрифужную пробирку диаметром 1,5 миллиметра, не потревожив гранулу. Затем подтвердите отсутствие шариков агарозы протеина L, промыв небольшое количество разведенного образца на внутренней стенке трубки.

Если присутствуют гранулы агарозы белка L, уменьшите образец еще на 30 секунд при 13 000 г и перенесите надосадочную жидкость в чистую пробирку. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не исчезнут шарики агарозы. Затем загрузите 10-20 микролитров разведенных образцов на лунку на полиакриламидный гель SDS и буферную систему трис-глицина SDS и запустите гель в течение примерно одного часа при напряжении 100 вольт на столе без дополнительного охлаждения.

Затем перенесите белки на мембрану из ПВДФ. Белки переносятся в течение двух с половиной часов в холодную камеру при напряжении 100 вольт с использованием буфера для переноса холода. Заблокируйте мембрану 10% веса на объем сухого молока в PBS-T на один час при температуре 25 градусов Цельсия на настольном орбитальном шейкере.

Промойте его дважды в течение 10 минут каждый раз с помощью PBS-T. Зондируйте мембрану с первичным антителом в 5% BSA в PBS-T. Инкубируйте на орбитальном шейкере в холодной комнате на ночь.

На следующее утро промойте мембрану одним разом с избытком PBS-T при температуре 25 градусов Цельсия, а затем три промывки PBS-T в течение 10 минут на орбитальном шейкере. Затем добавьте вторичное антитело и 5% сухого сухого молока в PBS-T в мембрану и инкубируйте его в течение одного часа при температуре 25 градусов Цельсия на орбитальном шейкере. После этого промойте мембрану один раз избытком PBS-T при температуре 25 градусов Цельсия, а затем три промывки PBS-T в течение 10 минут каждая на орбитальном шейкере.

Смешайте один миллилитр охлажденного улучшенного хемилюминесцентного подложки HRP компонента А с одним миллилитром компонента В при температуре 25 градусов Цельсия. Переложите мембрану на бумажное полотенце, чтобы удалить лишнюю жидкость. Затем просушите емкость бумажными полотенцами, прежде чем перенести мембрану обратно в нее.

Сразу же добавьте два миллилитра предварительно смешанного субстрата HRP с усиленной хемилюминесценцией и инкубируйте его в течение двух минут при температуре 25 градусов Цельсия. Наклоняйте емкость вручную каждые 20 секунд, чтобы равномерно увлажнить мембрану. После этого переложите мембрану в прозрачный пластиковый рукав и удалите лишнюю жидкость и пузырьки воздуха бумажными полотенцами.

Заклейте пластиковый рукав скотчем в кассету и закройте ее. На этом рисунке показано, что HigM12 иммунопреципитирует свой антиген из лизатов головного мозга и действует как детектирующий агент в вестерн-блоттингах. Ни антитела контроля изотипа, ни агарозные L-гранулы иммуноципитации не преципитируют аналогичный антиген, что демонстрирует специфичность вытягивания вниз.

Здесь вестерн-блоттинги с использованием лизатов ЦНС дикого типа и нокаутных мышей NCAM демонстрируют специфичность связывания HIgM с ПСА, содержащим NCAM'Enzymatic расщепление ткани ЦНС от мышей дикого типа с использованием ENDO-NF идентифицирует ПСА, прикрепленный к NCAM, как специфический связывающий апитоп для HIgM12. С помощью описанного здесь метода получают IBA-1 положительные микроглиальные культуры крыс высокой чистоты. В отличие от микроглии, поверхностные антигены клеток-мишеней HIgM12 и A2B5 были сильно обогащены в культурах OPC крыс в условиях живых клеток.

После освоения этой техники ее можно выполнить в течение 13 рабочих часов. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как Biacore или технология поверхностного плазмонного резонанса, для определения аффинности связывания антител с ассоциациями и ассоциативными константами. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследований рака, иммунотерапии и естественных аутоантител для идентификации углеводных апитопов на подобных белках в качестве антигенов для терапевтических антител IgM у человека.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как определить гликопротеиновые антигены для исследовательской работы, содержащие антитела IgM человека. Эти данные обеспечивают новую мишень для терапии рассеянного склероза. PSA ENCAP, разработанное нами лечение антителами, является одним из первых, которое показало функциональное улучшение в боксе активности с использованием строгой модели, которая присутствует в заболевании, и обесценивает болезнь, аналогичную рассеянному склерозу.