Простой и эффективный подход к Construct Mutant осповакцины вирусного вектора

Общей целью данного эксперимента является повышение эффективности генерации мутантного вируса коровьей оспы с использованием технологии CRISPR-Cas9. Этот метод может помочь в создании новых векторов вируса коровьей оспы для биологических исследований и медицинских исследований, в частности для генной терапии и вакцинации. Демонстрация вируса с помощью этого метода имеет решающее значение, потому что выявление и выявление положительных бляшек затруднительно выполнить.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она значительно повышает эффективность в создании нашего мутанта вируса коровьей оспы. Начиная с собранных клеток CV-1, отрегулируйте их концентрацию до 100 000 клеток на миллилитр. Затем засейте по два миллилитра суспензии в каждую лунку шестилуночного планшета для трансфекции.

На следующий день трансфектируйте клетки 0,5 нанограммами плазмиды гРНК-N2 и 0,5 нанограммами плазмиды pSTCas9. Затем инкубируйте их в течение 24 часов. Через 24 часа замените носитель.

Далее подготовьте вирус VVL15. Разбавьте основной вирус VVL15 с DMEM до 200 000 БОЕ на миллилитр. Затем добавьте по 100 микролитров разведенного вируса в каждую лунку трансфицированных клеток CV-1.

Через два часа трансфектируйте клетки одним микрограммом челночного донорского вектора для экспрессии HR и инкубируйте клетки в течение 24 часов. На следующий день отсоедините трансфицированные клетки CV-1 с помощью скребка для клеток. Затем соберите клеточную суспензию в криовиал и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего использования.

Чтобы начать первый раунд очистки модифицированного VV, засейте 15 шестилуночных планшетов по 300 000 немодифицированных клеток CV-1 в лунке. На следующий день разморозьте замороженную суспензию трансфицированных клеток CV-1 при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут, а затем энергично переведите суспензию на 30 секунд для лизирования клеток. Затем разведите один микролитр лизата с тремя миллилитрами DMEM.

Добавьте по полмиллилитра этого разбавления в каждую лунку пластины немодифицированных клеток CV-1. Затем верните тарелки в инкубатор на двое суток. Через два дня определите RFP-положительные бляшки с помощью флуоресцентного микроскопа.

Их можно заметить с помощью объектива 10X. Когда они будут идентифицированы, точно обозначьте таблички под табличкой с помощью маркера. Теперь приготовьте криовиал, содержащий 200 микролитров бессывороточного DMEM, для каждой положительной бляшки, которую необходимо собрать.

Далее важно аспирировать всю среду из лунок с помеченными бляшками. Затем с помощью набора на 200 микролитров для аспирации 30 микролитров частично загрузить пипетку 10 микролитрами среды из криовиала, а затем соскоблить бляшку и вытянуть клетки с оставшейся аспирацией. Извергните его в криовиальную камеру и повторите эту процедуру еще дважды, нацеливаясь на ту же RFP-положительную бляшку, чтобы собрать как можно больше клеток.

Храните сборы при температуре минус 80 градусов Цельсия или, если второй раунд очистки должен быть выполнен немедленно, заморозьте криовалиал на сухом льду на 10 минут. Второй раунд очистки модифицированного ВВ проводится так же, как и первый, с использованием замороженных клеток из первого раунда. Тем не менее, для каждой RFP-положительной линии можно выбрать более шести RFP-положительных бляшек.

Повторяйте процесс отбора до тех пор, пока все бляшки, образованные из одной положительной бляшки, не станут RFP-положительными, что указывает на чистоту бляшки, что может занять еще от трех до пяти раундов. За один день до этого подготовьте шестистенную пластину с полумиллионом элементов CV-1 в лунке. На следующий день разморозьте замороженный очищенный налет при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут.

Затем энергично оживите бляшку в течение 30 секунд, чтобы образовался лизат. Добавьте весь лизат, включая клеточный мусор, в лунку с клетками CV-1 и инкубируйте планшет в течение трех дней. Не используйте остальные пять лунок.

Ежедневно осматривайте клетки под микроскопом. Когда у более половины клеток появятся цитопатические, соберите инфицированные клетки. В идеале все клетки должны быть цитопатическими.

С помощью скребка для клеток соберите клетки в 15-миллилитровую пробирку с питательной средой. Затем гранулируйте ячейки по 300г в течение трех минут. Выбросьте надосадочную жидкость и продолжайте использовать ПЦР для проверки модификации мутантного VV или заморозьте клеточную гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия, чтобы сделать это позже.

Описанный метод повышает эффективность рекомбинации более чем в 100 раз по сравнению с традиционными протоколами. Например, VV N1LG был нацелен на модификацию. Как описано, плазмы, экспрессирующие Cas9, и N1L-специфичную гРНК котрансфицировали в клетки CV-1 для повышения их эффективности для гомологичной рекомбинации.

Через сутки после трансфекции в клетках CV-1 проводилась экспрессия RFP. Затем клетки CV-1 были инфицированы целым лизатом из гомологичной рекомбинации. RFP-положительные и отрицательные бляшки наблюдались в клетках CV-1.

Следуя протоколу очистки, получали чистый рекомбинант. Все бляшки после инфицирования клеточным лизатом, полученным из чистой бляшки с мутантным вирусом коровьей оспы, представили сигнал RFP. Для подтверждения делеции целевого гена использовали ПЦР.

Модифицированный вирус показал положительный сигнал для RFP и не показал сигнал для N1L, в отличие от интактного контроля N1L. Все они были положительными на нецелевой ген A52R. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как быстро сделать новый вектор вируса коровьей оспы.

После освоения этой техники ее можно сделать за 10 дней, если она выполнена правильно. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биомедицинских наук к исследованию новых вирусных векторов в разработке биологических агентов для лечения и профилактики рака и инфекционных заболеваний.