Эффективный метод получения Дедифференцированные жировых клеток

Общая цель этого нового метода культивирования клеток заключается в получении дедифференцированных жировых клеток с большей эффективностью. Наш метод может помочь исследователям, работающим в области регенеративной медицины, ответить на ключевые вопросы о нескольких процессах, связанных с производством адипогенных, остеогенных и хондрогенных клеток. Поскольку основное преимущество нашего протокола культивирования клеток заключается в том, что он повышает качество клеток Defat, он может быть применен в ближайшем будущем для улучшения текущих применений в клеточной терапии и тканевой инженерии.

После того, как вы принесли образец подкожного жира пациента в лабораторию из операционной, взвесьте ткань и поместите образец жировой ткани весом от одного до двух граммов в 15-миллилитровую пробирку. Затем промойте образец пятью миллилитрами PBS, а затем переложите образец в пластиковую посуду размером 10 сантиметров. Снимите PBS.

Затем добавьте 10 миллилитров стерильной коллагеназы 0,1% от массы на объем в чашку, содержащую образец. Далее с помощью хирургических ножниц измельчите ткань до тех пор, пока она не достигнет пюре из консистенции. Перелейте измельченную ткань и раствор коллагеназы в центрифугу объемом 15 миллилитров и варите при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, встряхивая при 60 оборотах в минуту.

После разложения отфильтруйте переваренный образец через фильтр 100 микрон в свежую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем пропустите через фильтр 10 миллилитров питательной среды DEFAT с добавлением 2% FBS. Чтобы изолировать жировые клетки от клеточной суспензии, сначала центрифугируют отфильтрованные клетки при 100-кратном g в течение одной минуты при комнатной температуре.

Во время центрифугирования приготовьте пять миллилитров DCM с добавлением 2% FBS в 15-миллилитровой пробирке. Затем с помощью пипетки объемом 1000 микролитров наберите плавающие жировые клетки из центрифужированной пробирки и добавьте клетки в 15-миллилитровую пробирку, содержащую среду. Осторожно встряхните пробирку, чтобы смешать среду DCM с клетками.

Затем центрифугируйте пробирку при 100-кратном g в течение одной минуты при комнатной температуре. После центрифугирования используйте иглу 18 калибра и шприц объемом 20 миллилитров, чтобы удалить среду на дне пробирки. Затем добавьте в клетки 10 миллилитров DCM с добавлением 2% FBS и перемешайте, осторожно встряхивая пробирку.

Снова центрифугируйте клетки при 100-кратном g в течение одной минуты при комнатной температуре. Чтобы начать нанесение покрытия, добавьте в колбу 41 сантиметр 41 миллилитр DCM или DMEM с добавлением 20% FBS. Затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров наберите 40 микролитров жировых клеток и добавьте их в колбу.

Затем наполните колбу DCM или DMEM с добавлением 20% FBS. Крайне важно, чтобы клетки были распределены по всей среде. Поставьте колбу на крышку круглой чашки Петри, чтобы она оставалась плоской.

Наконец, поместите колбу в инкубатор с 5% углекислым газом и температурой 37 градусов Цельсия и оставьте ее в покое на семь дней. После недели инкубации переверните колбу и проверьте наличие дедифференцированных жировых клеток. Далее аспирируйте среду, а затем добавьте в колбу пять миллилитров DCM или DMEM с добавлением 20% FBS.

Дайте клеткам DEFAT расти еще неделю после смены среды. Через неделю используйте счетчик клеток, чтобы подсчитать количество клеток Defat, полученных в различных условиях клеточной культуры. На этом изображении показаны колонии клеток DEFAT после 14 дней культивирования в DMEM.

Здесь клетки DEFAT показаны после 14 дней культивирования в ДКМП. В каждом случае масштабная линейка представляет 200 микрон. Пролиферацию клеток DEFAT количественно оценивали с помощью клеточного счетчика, а также сравнивали эффективность DCM и DMEM в генерации клеток Defat.

Как видно на рисунке, при использовании ДКМП наблюдается усиленная пролиферация клеток. Здесь человеческие клетки Defat, полученные с помощью DCM, культивировались в течение трех недель в соответствующей индукционной среде для оценки способности клеток DEFAT к редифференцировке и дифференцировке. Клетки были положительными на остеогенную способность при окрашивании щелочной фосфатазой и окрашивании Alizarin Red S. Наконец, адипогенная способность была продемонстрирована при окрашивании Oil Red O.

Очень важно убедиться, что коллагеназа с рудиментом и выделение жировых клеток выполняются с максимальной осторожностью, чтобы успешно генерировать высококачественные клетки Defat. Благодаря этим усилиям наш валидированный метод культивирования клеток призван облегчить как текущие, так и будущие исследования в области биологии развития и регенеративной медицины.