Разработка и ведение доклинической пациента Derived Опухоль модели ксенотрансплантата для исследования принципиально новых видов лечения рака

Используя опухоли пациента, полученных в подкожный доклинической модели является отличным способом для изучения эффективности новых методов лечения, открытие предиктивного биомаркеров и путей лекарственной устойчивостью. Эта модель, в процессе разработки лекарственных средств, имеет важное значение в определении судьбы многих новых видов лечения противоопухолевыми до клинического исследования.

Общей целью этой подкожной процедуры ксенотрансплантата опухоли, полученной от пациента, является изучение эффективности новых методов лечения, прогностического обнаружения биомаркеров и лекарственно-устойчивых путей в опухолях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области онкологии о том, проявляет ли тот или иной препарат активность в отношении определенного типа опухоли. Основное преимущество этой методики заключается в том, что ксенографы опухолей, полученных от пациента, сохраняют молекулярную, генетическую и гистологическую гетерогенность, типичную для опухолей происхождения, что делает модель более клинически значимой.

Демонстрировать процедуру будет Стейси Бэгби, профессиональный научный сотрудник и сертифицированный ветеринарный техник из нашей лаборатории. После сбора одного-двух миллилитров крови в пробирку для разделения клеток крови, содержащую цитрат натрия, центрифугируйте образцы и перенесите слой мононуклеарных клеток периферической крови в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Заполните пробирку доверху стерильным PBS.

Затем снова прокрутите ячейки вниз. Затем следует быстрое промывание одним миллилитром PBS, стараясь не потревожить гранулы PMBC. Затем с помощью пипетки перенесите плазму из пробирки для сбора клеток крови в стерильный криогенный флакон объемом 1,5 миллилитра и храните плазму и гранулу PBMC при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Перенесите опухолевую ткань человека в помещение для животных в стерильной чашке, содержащей готовую среду, и поместите чашку в колпак с ламинарным потоком. Как можно скорее, после забора, переложите ткань в стерильную пластиковую форму для резки в небольшом количестве питательной среды. Затем, используя простерилизованные в автоклаве маленькие ножницы и щипцы, разрежьте ткань примерно на три на три на три миллилитра и поместите от 10 до 12 штук в автоклавную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров, содержащую 300 микролитров раствора смеси желатинового белка на льду для имплантации.

Для хранения в мгновенной заморозке переложите соответствующее количество кусочков опухоли в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и поместите флакон в дозатор жидкого азота. Затем поместите в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для формального закрепления и введения парафина поместите три небольших кусочка опухоли в чашку объемом 10 миллилитров с 10% формалином на 24 часа.

После того, как ткани будут переработаны в блоки, залитые парафином, перенесите оставшиеся кусочки ткани в криогенную трубку. Затем добавьте в ткань один миллилитр готовой среды, обогащенной 10% ДМСО, и храните пробирки на льду до тех пор, пока их можно будет переложить в контейнер для заморозки изопропилового спирта. И поставьте этот контейнер в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Чтобы ввести опухолевую ткань, загрузите кусочки опухоли, хранящиеся в растворе смеси желатинового белка, в автоклавные троакары 12-го калибра, следя за тем, чтобы каждый кусочек опухоли был полностью вставлен в троакар. Затем подтвердите отсутствие реакции на защемление пальца ноги у шести-восьминедельной атимической обнаженной мыши и перенесите мышь на чистое поле в стерильный капюшон с ламинарным потоком. Доставьте опухоль F0 подкожно в область тыльной части шеи и с каждой стороны бока мыши, с последующим подкожным введением анальгезии дистальнее одного из фланговых участков инъекции опухоли.

Затем поместите мышь обратно в клетку с мониторингом до полного восстановления. Отслеживайте рост и состояние здоровья мышей, имплантированных с помощью ксенографа, не реже одного раза в неделю, записывая размеры опухоли, генерацию опухоли, дату инъекции опухоли и состояние здоровья мышей в соответствующей системе слежения. Когда опухоль достигает размера примерно от 1500 до 2000 кубических миллиметров, используйте автоклавные ножницы и щипцы для вырезания опухоли и введения опухоли F1 в следующее поколение из пяти животных, как только что было продемонстрировано, позаботившись о сборе мгновенно замороженного формалина и жизнеспособных образцов опухоли, как было продемонстрировано для каждой опухоли.

Когда у оставшихся мышей из группы опухолей F0 обнаруживаются опухоли размером примерно от 1500 до 2000 кубических миллиметров, соберите эти опухоли так, как только что было продемонстрировано для сбора. Когда будет достигнута стадия генерации опухоли F15, используйте самое раннее поколение жизнеспособных опухолевых фрагментов, доступных в хранилище жидкого азота, для следующей серии инъекций опухоли. Когда желаемая опухоль очень большая, от 1500 до 2000 кубических миллиметров, следуйте описанным выше процедурам, чтобы собрать опухоль и расширить ее до желаемого количества мышей.

Дозируйте мышей препаратом, взвешивайте и измеряйте их два раза в неделю. Рандомизируйте мышей на группы лечения с 10 опухолями в каждой группе и средним объемом опухоли от 100 до 300 кубических миллиметров в пределах нескольких стандартных отклонений друг от друга. Затем отсортируйте мышей по соответствующим группам для лечения.

Двухцветная флуоресцентная гибридизация in situ для человека и мыши, пойманной на одной ДНК, демонстрирует, что стромальные клетки человека в опухоли F0 заменяются стромальными клетками мыши в опухоли F1. В то время как весь человеческий фактор роста гепатоцитов в поколении F0 заменяется фактором роста гепатоцитов мыши в поколении F1, лиганд фактора роста эндотелия сосудов состоит из белка человека и мыши в поколении F1. Лечение разных поколений одной и той же опухоли не изменяет реакцию на лечение.

При этом резистентность или чувствительность опухоли проявляется скорее как штамм опухоли, чем специфичный для генерации опухоли. Кроме того, частота мутаций в этих обычно мутировавших генах очень схожа между атласом генома рака и банком ксенографов опухолей, полученных от колоректального пациента. Это позволяет предположить, что общие мутации, наблюдаемые в популяции пациентов с колоректальной кишкой, хорошо представлены в модели ксенотрансплантата, полученной от колоректального пациента.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один-два часа, если она выполнена правильно. При проведении этой процедуры важно иметь сплоченную клиническую команду для выявления и получения согласия от онкологических больных, а также для удаления и грубости опухолевой ткани. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как исследование противораковых соединений в виде одиночных или комбинированных агентов, чтобы ответить на дополнительные вопросы о жизнеспособности этих стратегий для пациентов с определенным типом опухоли.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области онкологии к изучению новых методов лечения рака, гетерогенности опухолей, механизмов резистентности к лечению, биологии раковых стволовых клеток и взаимодействия опухолевых стромальных взаимодействий. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разработать и поддерживать модель ксенографа опухоли, полученной от пациента, для оценки новых методов лечения рака.