Мимической опухолевого микроокружения: Простой метод для генерации обогащается мобильных групп населения и исследование межклеточной коммуникации

Общая цель этой простой модели кокультуры in vitro состоит в том, чтобы имитировать характеристики микроокружения опухоли in vivo, обогатить отдельные клеточные популяции и исследовать различные режимы межклеточной коммуникации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака и радиобиологии, в частности, в отношении факторов, лежащих в основе генерации связанных с раком фибробластов и реакции на терапевтические агенты. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет создавать отдельные клеточные популяции из смешанной клеточной культуры без стресс-индуцированной флуоресцентной маркировки или сортировки клеток.

Начните с двукратного промывания интересующей клеточной культуры пятью миллилитрами PBS. После второго промывания отсоедините ячейки с одним миллилитром трипсина-ЭДТА комнатной температуры на две минуты при комнатной температуре. Затем погасите реакцию девятью миллилитрами полной питательной среды, аккуратно проведя пипетированием среду по поверхности колбы 10 раз, чтобы диссоциировать клетки.

После подсчета разведите клетки в соотношении 2,5 раза по 10 до пятой клетки на миллилитр в свежей среде, и переложите клетки в стерильную центрифугу объемом 15 миллилитров. Раскрутите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде с добавлением 50% фетальной бычьей сыворотки в соотношении 2,5 раза по 10 к пятой клетке на 70 микролитров средней концентрации. Далее переложите вкладыши соответствующего экспериментального размера пор из их упаковки в отдельные лунки многолуночной чашки и накройте чашку.

Затем, придерживая блюдо обеими руками, аккуратно переверните блюдо до тех пор, пока донышки вставки не окажутся обращены вверх. Снимите дно посуды. Используя стерильные щипцы в одной руке, удерживайте одну вставку на месте, а другой рукой медленно отсасывайте 70 микролитров клеток в наконечник микропипетки.

Затем медленно распределите ячейки по поверхности того, что теперь является верхней стороной вставки. После посева каждой из вставок осторожно замените дно чашки и инкубируйте перевернутую чашку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа с влажностью от 30 до 45 минут. В конце инкубации, в ламинарном потоке шкаф биологической безопасности осторожно переверните чашку так, чтобы дно вкладышей теперь было обращено вниз.

Затем медленно и осторожно погрузите дно каждой вставки в два миллилитра предварительно подогретой полной среды, и поместите чашку обратно во увлажненный инкубатор. Через 48 часов замените среду на дне каждой лунки двумя миллилитрами свежей среды для роста. Когда вся среда будет обновлена, высейте 2,5 раза по 10-пятую ячейки второй интересующей популяции на верхнюю часть вкладышей в один миллилитр свежей среды и верните чашку в инкубатор.

Через 24, 48 и 96 часов замените среду в верхней части каждой вставки одним миллилитром свежей полной среды. А среда на дно каждой лунки с двумя миллилитрами свежей полной среды. После 120 часов совместного культивирования перекладывайте по одному вкладышу за раз в отдельные 35-миллиметровые чашки для клеточных культур, содержащие один миллилитр PBS.

И вымойте дно и верхние части вставок одним миллилитром PBS. Чтобы собрать выращенные на дне вкладыша клетки, поместите вкладыши нижней стороной вниз в 200 микролитров трипсина-ЭДТА комнатной температуры. Через две минуты при комнатной температуре прекратите реакцию с 800 микролитрами полной питательной среды.

Затем, держа вставку под небольшим углом, аккуратно провести пипеткой надосадочную жидкость по поверхности клеток 10 раз, собирая клетки в чашку. Когда все вкладыши будут удалены, ресуспендируйте клетки в концентрации от двух до 10 до пятых клеток на миллилитр питательной среды. И добавьте 250 микролитров клеток на стерильные индивидуальные стеклянные покровные стекла.

Поместите покровные стекла во увлажненный инкубатор на один час. В конце инкубации, в шкафу биологической безопасности с ламинарным потоком, осторожно добавьте в чашку два миллилитра полной питательной среды и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5%-ном проценте углекислого газа с влажностью в течение 48 часов. Затем трижды промыть клетки с помощью PBS.

После третьего промывки зафиксируйте клетки в 4%-ном формальдегиде в PBS на десять минут при комнатной температуре, после чего последует пять промываний трис-буферным физиологическим раствором. После последней промывки пермеабилизируйте клетки 0,25% Triton X-100 с добавлением 0,1 сапонина в течение пяти минут при комнатной температуре, после чего инкубируйте в блокирующем растворе в течение одного часа при комнатной температуре. Затем пометьте образцы первичным антителом, представляющим интерес, в блокирующем растворе при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи.

На следующее утро удалите несвязанное антитело с помощью трехминутных промываний в растворе для промывки, после чего следует одночасовая инкубация при комнатной температуре в соответствующем вторичном антителе в блокирующем растворе. В конце инкубации промойте несвязанное вторичное антитело, как показано только что на рисунке, и закрепите покровные стекла на отдельных предметных стеклах с помощью защитной от выцветания монтажной среды, содержащей DAPI. Заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей.

Затем визуализируйте клетки при 63-кратном масляном увеличении на инвертированном микроскопе, оснащенном внешним источником света для возбуждения флуоресценции. Эта система позволяет выращивать две различные клеточные популяции по обе стороны от пористых мембран вставок для клеточных культур в течение не менее 120 часов, поддерживая чистоту более 99% клеточных популяций по обе стороны мембраны, когда используются вставки с порами 0,4 или 1 микрона. Однако вставки с порами в три микрона достаточно велики, чтобы позволить клеткам мигрировать через мембрану, как это было показано в этом эксперименте с использованием GFP-положительной клеточной линии рака молочной железы человека.

Вставки с порами размером 0,4 микрона также ограничивают образование функциональных щелевых соединений между культурами клеток с обеих сторон вставки, ограничивая коммуникацию с секретируемыми факторами. Однако вставки с порами в один и три микрона обеспечивают функциональную связь клеток через щелевые соединения, на что указывает перенос флуоресцентной метки через мембрану в этих кокультурах. Важно отметить, что эта система может быть использована для эффективного получения ассоциированных с раком фибробластов из нормальных диплоидных фибробластов человека после их совместного культивирования с клетками рака молочной железы, о чем свидетельствует сниженная экспрессия кавеолина-1 на фибробластах, совместно культивируемых с клетками рака молочной железы человека.

При попытке выполнить эту процедуру важно выбрать вставки с размером пор, достаточным для исследуемого вопроса. А увидеть первую популяцию клеток можно на нижней стороне вставки в среде, что облегчает их прикрепление. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноблоттинг, иммунофлуоресценция in situ или большинство других клеточных анализов, чтобы ответить на дополнительные вопросы об изменениях экспрессии белков, изменениях в инвазии и миграции или различиях в ответах на терапевтические агенты.

После своего развития эта методика открыла путь исследователям в области биологии рака и радиационной биологии к изучению факторов, способствующих развитию, эволюции микроокружения опухоли, а в нашем случае и распространению вредного воздействия ионизирующего излучения от клеток-мишеней с радиацией на клетки-свидетели в окрестностях. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как готовить смешанную клеточную кокультуру, поддерживать кокультуру и собирать высокочистые обогащенные клеточные популяции из кокультуры для дальнейшего анализа. Не забывайте, что работа со штаммами клеток человека или клеточными линиями может быть опасной, и что при выполнении этой процедуры необходимо носить соответствующие средства индивидуальной защиты и соблюдать надлежащие правила биобезопасности.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.