Выделение липопротеидов высокой плотности для Некодирующих малых РНК квантификации

Общая цель этого протокола заключается в количественном определении малых некодирующих РНК в очищенных липопротеинах. Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы в области липопротеинов, такие как определение сигнатур малых РНК липопротеинов в норме и при заболеваниях, а также продвижение малых РНК липопротеинов в качестве биомаркеров болезней или межклеточных сообщений. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно анализировать высокочистые липопротеиды на наличие малых изменений РНК при заболевании или в экспериментальных условиях.

Применение этого метода распространяется и на терапию кардиометаболических заболеваний, поскольку внеклеточные РНК являются новым классом биомаркеров заболеваний, а малые РНК липопротеинов обладают захватывающим потенциалом в качестве мишеней для лекарств в будущих исследованиях. Хотя этот метод предназначен для малых РНК ЛПВП, он также может быть адаптирован для малых РНК липопротеинов очень низкой и низкой плотности. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности из-за отсутствия надлежащего оборудования и опыта в подготовке образцов для ультрацентрифугирования с градиентом плотности.

Этот протокол состоит из установленных методов, связанных друг с другом для количественного определения малых РНК на высокочистых ЛПВП с использованием высокопроизводительного секвенирования или ПЦР в реальном времени. В этом видео речь идет об очищении ЛПВП. Этот протокол будет продемонстрирован моим помощником, Эваном Шадари.

Для начала добавьте 90 микролитров 100-кратных антиоксидантов к девяти миллилитрам плазмы. Затем отрегулируйте плотность плазмы до 1,025 грамма на миллилитр, добавив 0,251 грамма бромида калия на каждые девять миллилитров плазмы. Раскачивайте плазму при комнатной температуре, пока вся соль не растворится.

Затем перенесите плазму в ультрацентрифужные пробирки и убедитесь, что наверху есть слой пузырьков. Под плазмой не должно быть воздуха. Затем подготовьте иглу 18 калибра, добавив изгиб на 90 градусов в одном сантиметре от кончика, скошенной стороной вверх.

Затем с помощью шприца и согнутой иглы аккуратно нанесите на плазму три миллилитра накладочного раствора номер один. Удалите большую часть пузырьков на поверхности и оставьте два-три миллиметра между мениском и краем трубки. Затем осторожно поместите трубки в ведра SW 40 Ti.

Взвесьте каждое ведро с крышками, и точно сбалансируйте ведра, которые будут занимать противоположные позиции в центрифуге. Затем поместите ротор в ультрацентрифугу и запустите ее при перегрузке 274, 400 раз G в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия, при этом разрыв установлен промежуточным значением четыре. На следующий день осторожно снимите ведра с ротора, а трубки поднимите из ведер.

Затем медленно снимите два миллилитра с верхнего слоя накладки, используя шприц и согнутую иглу. Это дробь ЛПОНП IDL. Затем соберите оставшиеся семь миллилитров плазмы, и перенесите их в коническую трубку объемом 15 миллилитров.

Доведите объем плазмы до девяти миллилитров, добавив оверлейный раствор номер два. Затем отрегулируйте плотность до 1,080 грамма на миллилитр, добавив 0,746 грамма бромида калия. Далее аккуратно покачивайте образец для растворения соли, на что уйдет около 20 минут.

Затем перенесите образец в ультрацентрифужную пробирку без улавливания воздуха. Следите за тем, чтобы сверху был сделан слой пузырьков. С помощью согнутой иглы аккуратно насыпьте три миллилитра накладки раствора номер три.

Затем удалите большую часть пузырьков и осторожно загрузите пробирки в ведро SW 40 Ti. Сбалансируйте их и вращайте, как описано ранее, в течение 24 часов. На следующий день аккуратно снимите два миллилитра с верхнего слоя накладки с помощью изогнутой иглы.

Это фракция ЛПНП. Затем переложите оставшийся образец в новую коническую пробирку объемом 15 миллилитров, а раствором номер четыре доведите объем до девяти миллилитров. Теперь отрегулируйте плотность до 1,30 грамма на миллилитр, добавив около 3,33 грамма бромида калия и покачивая образец до тех пор, пока соль не растворится.

Затем переложите образец в ультрацентрифужную пробирку и осторожно перелейте три миллилитра раствора номер пять. Теперь ультрацентрифугируйте образец, как и раньше, но в течение 48 часов. Через два дня соберите верхние два миллилитра накладки с помощью шприца и согнутой иглы.

Это и есть фракция ЛПВП. Чтобы удалить растворы с высоким содержанием солей, перенесите фракцию ЛПВП во влажный рукав для диализа с отсечкой 10 000 молекулярной массы. Затем диализуйте его в течение 24 часов в литре одного XPBS при слабом помешивании при температуре четыре градуса Цельсия.

Замените раствор PBS три раза в течение 24 часов. Позже определяют концентрацию белка фракции ЛПВП с помощью метода BCA. Внеклеточные везикулы, или экзосомы, имеют плотность, аналогичную малым ЛПВП, и, таким образом, могут присутствовать в той же фракции плотности, что и ЛПВП.

Таким образом, фракция ЛПВП требует дальнейшей очистки методом FPLC. Непосредственно перед использованием FPLC пропустите 1,2 миллиграмма фракции DGUC HDL в 500 микролитров раствора через центробежный фильтр 0,22 микрона. Соберите отфильтрованный образец в шприц для инъекций FDLC, следя за тем, чтобы пузырьки воздуха не попали в ловушку.

Далее установите расход FPLC на 0,3 миллилитра в минуту с пределом давления в 2,6 мегапаскаля. Затем уравновесьте столбцы объемом буфера 0,2 столбца. Теперь введите образец с тремя миллилитрами буфера в инструмент FPLC и запустите прогон.

Соберите 1,5 миллилитровые фракции, всего 72 фракции. Определите фракции FPLC, соответствующие DGUC HDL, путем определения уровня общего холестерина с помощью колориметрического набора в соответствии с инструкциями производителя. Ожидайте найти от шести до семи фракций FPLC, содержащих DGUC HDL.

Объедините все фракции, содержащие ЛПВП, и сконцентрируйте их с помощью центробежного фильтра с отсечкой 10 килодальтон при 4000 G в течение часа при четырех градусах Цельсия или до тех пор, пока концентрат ЛПВП не составит примерно 100 микролитров. Затем соберите концентрат ЛПВП и количественно определите белок с помощью метода BCA. Позже используйте такое же количество общего белка ЛПВП для выделения РНК.

Плазму крови человека фракционировали методом FPLC без использования разделения по градиенту плотности. Шесть фракций соответствовали ЛПВП и шесть – липопротеинам очень низкой плотности. Липиды в черном цвете, холестерин в красном и белок в синем цвете были измерены с помощью колориметрических наборов.

Для сравнения, использование ультрацентрифугирования с градиентом плотности до FPLC привело к обнаружению липидного белка и холестерина почти исключительно во фракциях ЛПВП. Из ЛПВП, взятых у четырех здоровых доноров плазмы, была выделена общая РНК и секвенирована с использованием протокола одного чтения 50 пар оснований. Распределение нормализованных прочтений иллюстрирует обогащение малых РНК вокруг 21 и 34 нуклеотидов.

Анализ библиотеки показал, что 38 процентов прочтений были микроРНК, а 37 процентов были получены из ТРНК. Также присутствовали различные РНК, рибосомные РНК, малые РНК, малые ядрышковые РНК и длинные некодирующие РНК. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение десяти дней, если все сделано правильно.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о валидации изменений малой РНК ЛПВП, наблюдаемых при высокопроизводительном секвенировании, с помощью другого метода, такого как ПЦР или нортерн-блоттинг. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как способность принимать е-поток холестерина ЛПВП и противовоспалительные СА ЛПВП, на этапах выделения РНК и подготовки к секвенированию, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение корреляции между изменениями малых РНК ЛПВП и функцией ЛПВП. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области липидов и липопротеинов для изучения нехолестериновых грузов, в частности нуклеиновых кислот и метаболических заболеваний, таких как гиперхолестеринемия или диабет.

И не забывайте, что работа с человеческой плазмой может быть крайне опасной, и при выполнении этой техники необходимо пройти надлежащую подготовку по болезнетворным микроорганизмам, передающимся через кровь, а также надеть соответствующие средства индивидуальной защиты.