Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать, как капиллярная электрофорез-масс-спектрометрия (CE-MS) с использованием интерфейса без оболочки с пористым наконечником может быть использована для анализа высокополярных и заряженных метаболитов. Предполагая, что метаболиты часто не могут быть заряжены, и они могут быть катионными или анионными, и для их разделения наиболее подходящим методом является электролитическое разделение, такое как капиллярный электрофорез. Однако в последние годы чувствительность была недостаточно хорошей.

Это было связано с интерфейсом, а также с тем, что метод не был надежным. Но я думаю, что мы неплохо решили обе проблемы, используя ножны в качестве свободного интерфейса и используя этот новый протокол. Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия с использованием нового интерфейса пористого наконечника без оболочки может быть использована для решения ключевых клинических вопросов в области метаболомики.

Например, с помощью этой технологии можно легко выполнить профилирование высокополярных заряженных метаболитов. S композиты разделены на основе соотношения заряда к размеру. Чаще всего эта методика очень подходит для профилирования такого типа соединений, меченных по биологическим образцам.

Уникальной особенностью предлагаемой методологии CE-MS без оболочки является то, что они могут быть использованы для профилирования анионных и катионных метаболитов только путем переключения полярности напряжения CE и полярности детектирования MS. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что КЭ-МС считается относительно новым и сложным методом. Чтобы начать эту процедуру, поместите новый картридж с чистым плавлением и излучателем с пористым наконечником в инструмент для электрофореза в капиллярной зоне, или инструмент CE.

Нанесите промывку метанолом при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 15 минут с помощью программного обеспечения, управляющего прибором CE. И визуально проверить, не вытекает ли жидкость из капиллярного выхода. Затем промывайте в обратном направлении при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение пяти минут с использованием фонового электролита или раствора BGE, чтобы визуально проверить, вытекает ли жидкость из проводящего капилляра.

Повторите предыдущий шаг при давлении 100 фунтов на квадратный дюйм в случае, если не наблюдалось вытекания жидкости из капиллярного выхода. Затем промойте разделительный капилляр водой при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 минут, затем добавьте 0,1 молярного гидроксида натрия при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 минут, воду при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 минут. После этого извлеките наконечник распылителя картриджа из плавленого кремнезема из водяной трубки и установите его в адаптер источника наноспрея для сопряжения с прибором MS.

Убедитесь, что высота флаконов с раствором BGE в приборе CE совпадает с высотой наконечника распылителя. Проверьте протекание жидкости через проводящий капилляр путем промывки раствором BGE при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение пяти минут. Во время этой стадии промывки следует следить за каплей жидкости у основания ионизирующего электроспрея или иглы распылителя ESI.

После промывки промойте разделительный капилляр раствором BGE при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 минут в прямом направлении. На этом этапе следует наблюдать каплю жидкости на кончике излучателя с пористым наконечником. Теперь расположите излучатель с пористым наконечником у входа в входное отверстие MS на расстоянии примерно двух-трех мм.

Подайте напряжение 30 кВ, используя время нарастания в одну минуту, и начните сбор данных МС в диапазоне массы к заряду от 65 до 1000 для исследований метаболического профилирования, используя сначала нулевое напряжение ESI. Установите напряжение ESI на 1000 В во время измерения данных. Увеличивайте напряжение ESI с шагом 200 В до тех пор, пока не будет наблюдаться постоянный фоновый сигнал в течение не менее 15 минут.

Переложите 20 микролитров заранее приготовленной стандартной смеси анионных метаболитов в пустую микрофлакону объемом 100 микролитров. Поместите микрофлакон во флакон CE и поместите флакон CE во входной лоток для образцов. Запустите ранее созданный метод регистрации МС в режиме отрицательных ионов, а затем запустите последовательность КЭ с помощью программного обеспечения, управляющего прибором КЭ.

После этого промойте разделительный капилляр раствором BGE при давлении 50 фунтов на квадратный дюйм в течение трех минут, после чего сделайте инъекции при давлении два фунта на квадратный дюйм в течение 60 секунд и один фунт на квадратный дюйм в течение 10 секунд. Подайте напряжение 30 кВ с нарастающим временем одной минуты и давлением 0,5 фунта на квадратный дюйм в течение 30 минут на входе. После 30-минутного электрофоретического разделения прекратите сбор данных MS и снизьте напряжение CE до 1 кВ, используя время нарастания в течение пяти минут.

Между впрыскиванием образца промойте разделительный капилляр водой, 0,1 молярного гидроксида натрия, водой и раствором BGE при давлении 30 фунтов на квадратный дюйм в течение трех минут. После завершения прогонов проанализируйте записанные данные, определив время миграции и интенсивность сигнала анализируемой смеси анионных метаболитов. Оцените, появляются ли стандарты анионных метаболитов в области между 10 и 28 минутами.

Затем проверьте, разделены ли частично три структурно родственных изомера: D-глюкозо-1-фосфат, D-глюкозо-6-фосфат и D-фруктоза-6-фосфат. Продемонстрирована эффективность разделения метода CE-MS без оболочки для анализа высокополярных анионных метаболитов для трех структурно связанных изомеров сахарофосфата. Несмотря на то, что исходное разделение для этих трех аналитов не было получено, частичное разделение достаточно для их селективного обнаружения с помощью МС, поскольку эти аналиты имеют одинаковую точную массу.

При анализе биологических образцов с помощью этой методологии CE-MS без оболочки важно регулярно проверять аналитические показатели с течением времени в соответствии с академическими стандартами. В целом, методология без оболочки позволяет профилировать эти типы соединений в сверхмалых биологических образцах, тем самым открывая множество возможностей для анализа этих типов образцов в областях биомедицинских наук, биоаналитической химии и научных исследований за их пределами. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как связать CE с MS через пористый интерфейс без оболочки для профилирования высокополярных и заряженных метаболитов.