Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении малых молекул, способных нарушать взаимодействие между каналами TRIP8b и HCN. Этот метод выявляет молекулы-кандидаты, которые могут быть разработаны для новых методов лечения депрессии. Основное преимущество этой технологии заключается в том, что она может быть выполнена с высокой пропускной способностью.

Этот метод имеет значение для разработки новой терапии большого депрессивного расстройства, поскольку наша лаборатория показала, что нарушение связывания TRIP8b с HCN может иметь терапевтическую пользу. Хотя этот метод был разработан с учетом депрессии, нарушение взаимодействия между TRIP8b и HCN может иметь терапевтическую пользу при других расстройствах, таких как хроническая боль. Визуальная демонстрация этого протокола важна, поскольку она иллюстрирует преимущества использования автоматизированных высокопроизводительных инструментов для продвижения фундаментальных и трансляционных исследований на открытых объектах, таких как высокопроизводительная аналитическая лаборатория Северо-Западного университета.

После очистки фрагмента белка TRIP8b 241-602 и изучения белковых взаимодействий с положительным контролем по текстовому протоколу разморозить аликвоты TRIP8b и HCN1-FITC и держать их на льду. Используйте FP Buffer для приготовления 20 миллилитров 2 микромолярного TRIP8b и 50 наномолярного HCN1-FITC. Затем дозируйте по 25 микролитров смеси в каждую лунку с низким связыванием 384 лунки с черным микротитрованием.

Для библиотечного скрининга используйте акустический манипулятор для дозирования 100 нанолитров соединений в каждую лунку колонок с 3 по 22 с конечной концентрацией 40 микромолей. Внесите по 100 нанолитров ДМСО в каждую лунку столбцов 1 и 23 в качестве отрицательного контроля. Диспонируйте по 100 нанолитров немеченного пептида HCN1 в каждую лунку столбцов 2 и 24 в качестве положительного контроля с конечной концентрацией 10 мкмоль.

Выдерживайте пластины при комнатной температуре в течение двух часов. С помощью считывателя пластин измерьте поляризацию флуоресценции. В качестве альтернативы пластины можно хранить в течение 16 часов при температуре 4 градуса Цельсия перед чтением.

Используя следующее уравнение, рассчитайте процент ингибирования, где XN — нормализованный процент ингибирования, соответствующий сигналу: X.X положительный — средний сигнал от положительных контрольных лунок, а X отрицательный — средний сигнал от отрицательных контрольных лунок. Для валидации хитов с ингибированием более 50% приготовьте мастер-смесь из 20 миллилитров 2 микромоляров TRIP8b и 50 наномоляров HCN1 TAMRA в буфере FP. Дозируйте по 25 микролитров мастер-смеси в каждую лунку черного 384-луночного микротитровального планшета.

Затем добавьте 100 нанолитров соединений из планшета, содержащего двукратные последовательные разведения каждого активного соединения, в соответствующие лунки. Для отрицательных контрольных лунок добавьте 100 нанолитров ДМСО. Для положительного контроля добавьте 100 нанолитров серийно разбавленного немеченого пептида HCN1 с конечными концентрациями от 200 мкм до 0,1 мкмоль.

Выдерживайте тарелку при комнатной температуре в течение двух часов, либо при температуре 4 градуса Цельсия в течение 16 часов. С помощью планшетного ридера измерьте поляризацию флуоресценции. Рассчитайте значения IC50, подогнав зависящие от концентрации данные FP каждого соединения, используя 4-параметрическую нелинейную регрессионную модель.

Разморозьте по одной аликвоте на каждый слитый белок HCN1, меченный HIS, TRIP8b и GST, и держите их на льду. Приготовьте 1 миллилитр 200 наномоляров HIS TRIP8b и 20 наномолей GST-HCN1C40 в буфере для каждого исследуемого соединения. С помощью 16-канальной пипетки добавьте 7 микролитров смеси HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 в три лунки на ряд рядов от A до N, чтобы проверить каждое соединение в трех экземплярах.

Кратковременно центрифугируйте пластину, чтобы убедиться, что жидкости находятся на дне каждой лунки, и удалить любые пузырьки. Затем дозируйте испытуемые соединения Hit в планшет для достижения конечной концентрации 200 микромолей в ряду А и заканчивая 0,1 микромолями в ряду L. Добавьте такой же объем ДМСО в ряд M. Затем дозируйте немеченный пептид HCN1 до конечной концентрации 10 микромолей в ряд N. Встряхните планшет в течение двух минут и инкубируйте в течение 2,5 часов при комнатной температуре. Используя буфер для анализа, разбавьте акцепторные гранулы Anti-GST в соотношении 1 к 50.

С помощью 16-канальной пипетки добавьте 3,5 микролитра разбавленных акцепторных шариков в каждую лунку пластины и перемешайте с помощью осторожного пипетирования, чтобы избежать образования пузырьков. Выдержите тарелку в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. Разбавьте донорские гранулы хелата никеля в соотношении 1:50 с помощью буфера для анализа, не подвергая смесь воздействию света.

Добавьте по 3,5 микролитра разведенных донорских шариков в каждую лунку пластины и аккуратно перемешайте, не допуская образования пузырьков воздуха. Укупорьте пластину и выдержите ее в темноте при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Затем используйте считыватель пластин для считывания показаний пластины с параметрами измерения, перечисленными здесь.

Наконец, рассчитайте значения IC50, подогнав данные для каждого соединения, используя 4-параметрическую нелинейную регрессионную модель. Для оценки взаимодействия с HCN1 TAMRA TRIP8b титровали до фиксированной концентрации HCN1 TAMRA. Этот график показывает, что по мере увеличения концентрации TRIP8b большее количество молекул HCN1 TAMRA связывается, и поляризация увеличивается.

В этом эксперименте, когда немеченый HCN1 титровали до фиксированной концентрации TRIP8b и HCN1 TAMRA, меченый пептид вытеснялся, а сигнал уменьшался. Высокопроизводительный скрининг показывает процентное ингибирование каждого соединения, представленное отдельными точками на графике. Результаты этого скрининга отображаются с положительным и отрицательным контролем, а также со средним процентом ингибирования каждого соединения в течение двух прогонов анализа.

Соединения, показывающие ингибирование более 50%, были затем проверены в этом эксперименте. Координаты X и Y определяли по процентному торможению в двух прогонах анализа. В этом эксперименте HCN1C40 содержит метку GST на конце клеммы, которая связывает бусины акцептора.

Взаимодействие TPR-доменов TRIP8b и С-концевого трипептида HCN1 возбуждает донорский шарик светом с длиной волны 680 нанометров с образованием синглетного кислорода. Наконец, как показано на этом графике, титрование возрастающих концентраций пораженного соединения NUCC-5953 до фиксированной концентрации TRIP8b и HCN1C40 увеличивало ингибирование взаимодействия TRIP8b HCN1. Перед началом высокопроизводительного скрининга проверьте белковый препарат и поляризацию флуоресценции в бесконтактных анализах на основе гранул.

Убедитесь, что белок имеет высокую чистоту. Аликвотируйте белок, чтобы избежать многократных циклов замораживания и размораживания. Важно использовать высококачественные реагенты, в том числе свежие ДМСО и Тритон.

Не забывайте, что работа с ДМСО может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как электрофизиология и проточная цитометрия, чтобы определить, проявляют ли пораженные соединения активность в клетках. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выполнять высокопроизводительный скрининг с помощью анализа на основе флуоресцентной поляризации.