Мультимодальные и обработки изображений Спектроскопия Волоконно-расслоение Microendoscopy Платформа для неинвазивного, В Vivo Анализ тканей

Общей целью этой процедуры является функциональная характеристика ткани in vivo путем объединения структурной информации с высоким разрешением с количественными спектральными данными. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области биологии рака, такие как количественная оценка влияния терапии на микроструктуру тканей и перфузию. Основное преимущество этого метода заключается в том, что один зонд может использоваться для сбора данных как изображения, так и спектроскопии из одного и того же места.

Применение этого метода распространяется и на терапию рака желудочно-кишечного тракта, поскольку зонд совместим с традиционными эндоскопическими методами. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что небольшие отклонения в размещении датчика могут значительно повлиять на точность данных. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы осознали важность сочетания метода визуализации с высоким разрешением и методом количественной спектроскопии.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы подготовки сложны из-за сложности как конструкции, так и калибровки. Чтобы начать сборку мультимодального микроэндоскопа для флуоресцентной микроскопии с высоким разрешением, установите дихроичное зеркало с яркостью 470 нанометров в 30-миллиметровый куб с клеткой. Прикрепите стержни для сборки клетки к передней, правой и левой сторонам куба клетки.

Прикрепите стопорное кольцо без напряжения к резьбовой пластине сепаратора и вкрутите трубку объектива в стопорное кольцо. Прикрепите еще одну пластину клетки к трубке объектива, совместимую с первой пластиной клетки. Затем закрепите алюминиевое зеркало с ультрафиолетовым излучением в прямоугольном креплении зеркала.

Прикрепите четыре стержня к передней части крепления зеркала и два стержня по диагонали к правой стороне крепления. Сдвиньте линзовую трубку в сборе на левую сторону куба клетки. Подсоедините правую сторону узла крепления зеркала к узлу линзы объектива.

Сдвиньте крепление для перемещения по оси Z на правую сторону сборки. Прикрепите 10-кратный ахроматический объектив к креплению для перевода. Затем закрепите волоконную переходную пластину на креплении для перемещения по оси XY.

Наденьте крепление на узел перед объективом. С помощью стопорных колец закрепите соответствующий фильтр возбуждения и фильтр излучения в трубках линз. Вкрутите трубку линзы фильтра возбуждения в переднюю часть клетки кубика.

А трубку объектива эмиссионного фильтра в переднюю часть правого угла крепления зеркала. С помощью эпоксидной смолы прикрепите светодиод с яркостью 455 нанометров к пластине клетки перед фильтром возбуждения. Сдвиньте пластину клетки перед каждой трубкой линзы с фильтром.

С помощью стопорного кольца закрепите ахроматическую линзу с дуплетной трубкой в другой линзовой трубке так, чтобы стрелка на внешней стороне линзы была обращена к внешней стороне линзовой трубки. Прикрепите тубусную линзу к левой пластине клетки, поместите другую пластину клетки перед линзой тубуса. С помощью прочного стопорного кольца прикрепите монохромную USB-камеру к пластине каркаса.

Чтобы начать сборку метода спектроскопии субдиффузного отражения, прикрепите пластину с резьбовым каркасом к передней части вольфрамового галогенного источника света с эпоксидной смолой. Вставьте четыре стержня узла сепаратора в пластину сепаратора и наденьте на стержни крепление для перемещения по оси Z. Вкрутите 20-кратный ахроматический объектив в крепление для перемещения по оси Z.

Подсоедините оптоволоконную переходную пластину к креплению для перемещения по оси XY и наденьте крепление на узел перед объективом. Наконец, закрепите оба узла на оптическом столе вплотную друг к другу с помощью соответствующих монтажных устройств. Чтобы приступить к созданию устройства сепарации детектора источника, вкрутите переходную пластину SMA с наружной резьбой в алюминиевый рычаг двигателя.

Прикрепите адаптер рычага двигателя к задней части рычага двигателя. Затем вкрутите шаговый двигатель в алюминиевый корпус двигателя. Наденьте узел рычага двигателя на шток двигателя и затяните стопорный винт.

Затем вкрутите три волоконные переходные пластины в оптический переключатель, а затем прикрутите лицевую панель к оптическому переключателю. Проденьте шток шагового двигателя через центральное отверстие оптического переключателя. Поместите драйвер шагового двигателя поперек центральной линии красной доски без дернина.

Подключите драйвер к соответствующему источнику питания и шаговому двигателю. Закрепите оптический переключатель на оптическом столе. Прикрепите патч-кабель 550 микрометров 0,22 na к рычагу двигателя.

Подключите другой конец к USB-спектрометру. Чтобы подключить оптоволоконный зонд, подсоедините центральный оптоволоконный кабель с изображением диаметром 1 миллиметр к узлу модальности флуоресцентной микроскопии с высоким разрешением. Подсоедините левый многомодовый кабель 200 микрометров к узлу модальности субдиффузного спектроскопии.

Продолжая слева, подключите оставшиеся многомодовые кабели по порядку к левому, среднему и правому адаптерам оптического коммутационного устройства. Чтобы начать калибровку для эксперимента, подключите к компьютеру все периферийные USB-устройства. Включите все приборы и убедитесь, что затвор вольфрамовой галогенной лампы открыт.

Затем выключите свет в комнате и закройте другие источники окружающего света. Откройте программу для сбора данных. Дайте оборудованию поработать в течение 30 минут, прежде чем приступить к калибровке.

Поместите стандарт диффузного отражения 20% в нижнюю часть калибровочного устройства. Вставьте оптоволоконный щуп в левый слот устройства и установите моторизованный оптический переключатель влево, чтобы выбрать 374 микрометра в качестве настройки DS. В программном обеспечении установите время интеграции на 500 миллисекунд.

Затем нажмите кнопку «Получить спектр», чтобы начать сбор данных RMAX для этого SDS. Когда сбор данных RMAX будет завершен, сохраните спектр в специальной папке. Закройте затвор вольфрамовой галогенной лампы и получите темный спектр R для этого паспорта безопасности.

Откройте затвор, переместите щуп в нужное гнездо в калибровочном устройстве и установите моторизованный оптический переключатель в среднее положение для настройки SDS 730 микрометров. Приобретите RMAX и RDARK для этого паспорта безопасности, чтобы завершить калибровку. Во-первых, определите подходящую область кожи для сбора данных.

Используя желтый маркер в качестве источника пиранина, слегка прокрасьте выбранный участок. Чтобы начать флуоресцентную микроскопию с высоким разрешением, включите светодиод с разрешением 455 нанометров и закройте затвор вольфрамовой галогенной лампы. Поместите волоконно-оптический зонд в мягкое соприкосновение с кожей.

Переместите зонд по ткани, окрашенной пиранином, чтобы отобразить архитектуру апикального тока. В программном обеспечении устанавливается подходящее время экспозиции и усиление, чтобы избежать насыщения изображения. Затем нажмите «Получить изображение», чтобы получить статическое изображение.

Удерживайте зонд на месте для проведения субдиффузной спектроскопии отражения. Выключите светодиод с яркостью 455 нанометров и откройте затвор вольфрамовой галогенной лампы. Затем переключитесь на настройку SDS 374 микрометра слева.

Нажмите кнопку Получить спектры, чтобы получить спектр R-ткани для этого паспорта безопасности. Затем переключитесь в среднее положение и получите спектр R-тканей SDS 730 микрометров. Откройте программу для постобработки и нажмите кнопку «Выполнить».

При появлении запроса выберите калибровочные спектры, спектры in vivo и флуоресцентное изображение с высоким разрешением, чтобы получить изображение ткани. Метод флуоресцентной микроскопии с высоким разрешением обеспечивает сфокусированное изображение участка ткани с высоким разрешением. При окрашивании пиранином видны отдельные очертания кератиноцитов.

Программное обеспечение для постобработки использует данные субдиффузной спектроскопии отражения для расчета концентрации гемоглобина, меланина и насыщения тканей кислородом. Доброкачественный меланоцитарный невус сравнивали с соседними нормальными тканями кожи с помощью этого мультимодального микроэндоскопа. Меланоцитарный невус показал несколько более низкую концентрацию гемоглобина и несколько повышенную концентрацию меланина по сравнению с нормальной тканью.

После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за час при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно дать вольфрамовой галогенной лампе нагреться в течение 15 минут и откалибровать приборы по стандарту отражения перед сбором данных. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как конфокальная микроскопия или многофотонная микроскопия, для изучения субклеточных изменений в структуре белка или метаболизме.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению взаимосвязи между перфузией тканей и микроструктурой в ответ на химиотерапию. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как построить и использовать гибридное микроэндоскопическое устройство для визуализации и спектроскопии.