Изучение вирусных векторов в Трехмерные модели печени заселен с клеточной линии человеческого гепатоцеллюлярной карциномой HepG2

Общей целью этой процедуры является разработка трехмерной модели печени для изучения вирусов и вирусных векторов. Этот метод позволяет изучать биологические процессы в васкуляризированной трехмерной системе с клетками человека, которые отличаются по своей физиологии от клеток грызуна в модели мыши или крысы. Кроме того, это шаг к улучшению благополучия животных, поскольку он позволяет избежать экспериментов с живыми животными и, в конечном счете, предназначен для полной замены компонентов животного происхождения.

Хотя мы разработали этот метод для изучения вирусных векторов для переноса генов, он также может быть применен для изучения инфекционных вирусов и других областей исследований, таких как исследования рака. Демонстрировать процедуру будет Виола Рорс, техник из моей лаборатории. В целях благополучия животных для настоящего исследования использовались только излишки животных, которые были принесены в жертву для других экспериментов на животных, т.е

для получения печеночных каркасов не потребовалось никаких дополнительных животных. Для начала сначала расширьте печеночную клеточную линию Hep G2. Поместите 15 миллионов клеток во флаконы Т175 в 30 миллилитров среды, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка и два миллимоля гулатмина, пенициллина и стрептомицина. После четырех дней культивирования используйте пятиминутное воздействие раствора трипсина в условиях культивирования, чтобы разрыхлить клетки, а затем соберите их.

Затем раскрутите ячейки при 300 G в течение трех минут. Затем повторно суспендируйте их в четырех миллилитрах PBS и подсчитайте количество клеток. Из каждой бутылки должно получиться около 45 миллионов клеток.

600 миллионов клеток необходимы для рецеллюляризации ВКМ печени крысы. Чтобы рецеллюляризировать ЭХМ, сначала установите систему биореактора, содержащую камеру для размножения печени, систему размножения, резервуар для среды и пузырьковую ловушку. Процедура рецеллюляризации состоит из двух важнейших этапов.

Один из них заключается в том, чтобы не задерживать пузырьки воздуха в системе изобилия. Второе заключается в том, что вся система должна содержаться стерильной. Сначала стерилизуйте эти компоненты биореакторной системы при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут.

Во-вторых, заполните трубки и стерилизованную камеру прогустителя средой. Затем поместите децеллюляризованный каркас печени крысы в камеру для обильной печени. Следующим шагом является использование зажимов для трубки для соединения канюлированной воротной вены с системой припухлости.

Теперь поместите систему биореактора в инкубатор и подключите ее к перистальтическому насосу. Далее уравновесьте скаффолд со 150 миллилитрами дополненной среды в течение пяти дней. Установите расход на 1,25 миллилитра в минуту.

Через пять дней отключите систему биореактора от насоса и переведите ее в стерильный колпак. Отсоедините каркас печени от контура среды. Затем загрузите в шприц пять миллилитров среды, содержащей 300 миллионов клеток Hep G2, и введите клетки через воротную вену, избегая образования пузырьков воздуха.

Затем дайте элементам повторно заполнить ECM в течение часа без запуска насоса. Через час запустите насос с 1,25 миллилитров в минуту. Через 10 минут увеличьте давление до 2,5 миллилитров в минуту.

Еще через 20 минут установите насос на рабочую скорость 3,75 миллилитра в минуту. Через 30 минут на полной скорости насоса выключите насос, добавьте еще 300 миллионов ячеек и дайте ячейкам заполнить ECM в течение часа. Через час постепенно увеличивайте циркуляцию, постепенно регулируя скорость насоса, как и раньше.

Теперь дайте культуре провести целлюляризацию печени в течение двух недель. Через день заменяйте 50 миллилитров среды и измеряйте физиологические параметры из образца используемой среды. Создание векторов AAV является сложной процедурой, включающей в себя множество этапов, которые обобщены в текстовом протоколе.

В этом разделе видео демонстрируются некоторые из важнейших шагов. Во-первых, создадите, очистите и количественно оцените векторы AAV. Кратко изготовьте векторы AAV в роликовых бутылках и очистите их с помощью градиентного центрифугирования йодиксанолом.

Удалите остатки йодиксанола путем фильтрации на фильтрующих колонках для геля PD10. Затем определите концентрацию вектора AAV с помощью QPCR с использованием геномной ДНК AAV в качестве стандарта. В общей сложности на одну модель требуется 27 триллионов векторов AAV.

Теперь трансдуцируйте модель печени. Во-первых, получите 27 триллионов векторов в пяти миллилитрах PBS, загруженных в шприц. Феноловый красный может быть добавлен в количестве 5 микрограммов на миллилитр.

Затем отключите печень от контура среды и введите векторы в систему. После инъекции инкубируйте систему в течение одного часа без сцеживания. Затем постепенно увеличивайте поток, как описано ранее.

В дальнейшем, по мере того как пересаженная печень инкубируется в течение шести дней, меняйте 50 миллилитров среды через день. С помощью скальпеля срежьте образцы из каждой доли печени толщиной около полусантиметра и длиной от 1,5 до двух сантиметров. Инкубируйте ломтики в 4% параформальдегиде с 4% сахарозой в течение 90 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем промойте образец три раза PBS в течение одной минуты за промывку. После промывки инкубируйте образцы в течение ночи в 8% сахарозе при четырех градусах Цельсия. На следующий день загрузите образцы в криоформы, содержащие некоторую фиксирующую среду.

Избегайте попадания пузырьков воздуха. После загрузки полностью накройте образцы фиксирующей средой и поставьте их при температуре минус 80 градусов Цельсия. После замораживания приготовьте криорезы размером 10 микрон из образцов с помощью криотома.

Окрашивайте образцы по мере необходимости, чтобы подтвердить рецеллюляризацию. Для анализа экспрессии генов возьмите образцы с помощью четырехмиллиметрового биопсийного пунша. Для оценки рецеллюляризации криосекции окрашивали гематоксилином и эозином.

Доли двух трансдуцированных печени и одной контрольной печени, которая была рецеллюляризована, но не трансдуцирована, были повторно заселены клетками Hep G2. Экспрессия РНК и титр векторов были количественно определены на основе 28 пункционных биопсий с каждой модели печени. В двух трансдуцированных моделях печени было измерено 55 и 90 векторных геномов на клетку, что является достаточным вектором для индуцирования сайленсинга генов.

В контрольной группе геномы не измерялись, как и ожидалось. Экспрессию EmGFP анализировали методами ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга. Большинство биопсий показали экспрессию мРНК EmGFP и экспрессию белка EmGFP.

Иммуностойкость криосрезов показала, что везде, где модель была успешно рецеллюляризирована, также можно было увидеть экспрессию EmGFP. Это свидетельствует о хорошей экспрессии гена AAV. Затем опосредованный AAV нокдаун человеческого циклофилина B был проанализирован с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Средний нокдаун человеческого циклофилина B составлял от 70 до 90% по всем долям двух трансдуцированных печени. После своего развития этот метод проложил путь исследователям к изучению распределения вирусов и вирусных векторов в васкуляризированной трехмерной системе органов. Такие исследования помогут усовершенствовать существующие методы переноса генов и помогут разработать новые противовирусные стратегии.