Протокол для анализа вируса гепатита С репликации

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании различных стадий цикла репликации вируса гепатита С. Это достигается путем создания сначала геномной РНК ВГС, транскриптов из линеаризованных плазмидных конструкций ВГС. Вторым шагом является трансфекция клеток H-C-V-R-N-A.

Затем клетки покрываются пламированием для различных временных точек и анализов. Заключительным этапом является сбор надосадочной жидкости клеточной культуры для измерения титра вируса и забор трансфицированных клеток на белок и РНК. В конечном итоге проводится обратная транскрипция, ПЦР, иммунофлуоресцентный анализ вестерн-блоттинга и титр ВГС, которые демонстрируют надежную систему культивирования инфицированных клеток ВГС.

Основное преимущество этой системы культивирования клеток вируса гепатита С по сравнению с репликантной системой ВГС заключается в том, что можно исследовать этапы сборки и выхода вируса. Этот протокол может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусологии гепатита С, такие как вион, морфогенез и взаимодействие патогена хозяина. Применение этого метода распространяется и на разработку вакцины, поскольку он позволяет охарактеризовать ослабленные штаммы вируса, которые могут быть оценены как потенциальные кандидаты на вакцинацию.

Хотя этот метод может дать представление о вирусе гепатита С, он также может быть применен к другим РНК-вирусам семейства лабораторных вирусов. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, сталкиваются с проблемой создания высококачественного исследования геномной РНК ВГС. Полный цикл репликации ВГС стал возможным в клеточной культуре после открытия изолята гепатита 1 японского фульминантного гепатита 1 генотипа А А.

Визуальная демонстрация вирусологического анализа имеет решающее значение, поскольку анализ потребует знаний как в молекулярных, так и в клеточных методах Использование химерного вируса внутригенотипа 2, F-N-X-H-C-V и F-N-X-H-C-V опроса нулевого HCV для оценки репликации вируса. Линеаризация ранее сгенерированных вирусных плазмид путем расщепления с помощью одного рестриктазового фермента XBA в двухмиллилитровой пробирке. Затем обработайте плазмиды нуклеазой бобов мунг, чтобы получить тупые концы.

Очистите расщепленные плазмиды с помощью анионообменной хроматографии. Проверьте целостность линеаризованной плазмиды, подвергнув ДНК электрофорезу в геле AROS. Затем добавьте линеаризованную матрицу плазмидной ДНК в пробирку объемом 0,2 мл, содержащую Т-семь компонентов реакции РНК-полимеразы Т, для синтеза транскриптов геномной РНК ВГС.

Очистите вновь синтезированные ДНК обработанной РНК с помощью набора для очистки РНК. Затем проверьте выработку РНК методом гель-электрофореза Агрос. После этого количественно определите РНК с помощью спектральной фотометрии.

Отделите семь адгезивных клеток на основе HU с помощью лечения ферментом трипсином и соберите клетки в коническую форму объемом 50 миллилитров. Два последующих центрифугирования. Суспензия клеточной гранулы в холодной среде с низким содержанием сыворотки После повторения центрифугирования повторно суспендируйте клетки в средах с низким содержанием сыворотки в соотношении от 10 до 7 клеток на миллилитр.

Затем смешайте в общей сложности 10 микрограммов транскрибированной вирусной РНК с 400 микролитрами ресуспендированных клеток в предварительно охлажденном 0,4-сантиметровом электропораторе, доставьте вирусную РНК в клетки с помощью электропорации при напряжении 270 вольт, 100 Ом и 950 микроферре. По окончании ресуспендируйте электропорированные клетки в 10 миллилитрах полной питательной среды с 15% FBS на этом этапе, нанесите пластины на клетки в обоих колбах с Т-25 примерно в соотношении 1,2 умножить на 10 до шести клеток в колбе и в 48-луночных планшетах в соотношении от 10 до 40-40 и 96-часовых временных точек. Замените среду через четыре-восемь часов после трансфекции свежей добавленной питательной средой с 10% FBS для удаления остатков мертвых клеток из культивируемых колб и планшетов.

С помощью серологической пипетки соберут надосадочную жидкость клеточной культуры в моменты времени 48 N 96 в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Затем удалите клеточный мусор из собранных образцов центрифугированием при 15 000 об/мин в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия после центрифугирования. Храните бесклеточную надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Лиз клеток для анализа белков и РНК методом вестерн-блоттинга и количественной ПЦР с обратной транскрипцией или R-T-Q-P-C-R в указанные моменты времени. Выполните обратную транскрибцию одного микрограмма общей клеточной РНК с использованием фермента обратной транскриптазы и специфического праймера для чувствительной цепи ВГС, которая связывается с пятью основными нетранслируемыми областями в пробирке объемом 0,2 миллилитра. Также выполните обратную транскрибацию F-N-X-H-C-V-R-N-A известных копий генома с помощью праймера чувствительной цепи HCV с использованием системы ПЦР в реальном времени.

Проведите ПЦР с использованием 50 нанограммов полученной транскрибируемой CD NA с использованием специфических праймеров ВГС и ДНК-связывающего зеленого красителя, содержащего суперсмесь КПКР. Используйте следующие условия при выполнении QPCR, чтобы определить номер копии H-C-V-R-N-A после QPCR. Растворяют лизат клеток из вирусной РНК, трансфицированной через 96 часов.

После трансфекции с помощью страницы SDS. Затем перенесите растворенные белки в геле на мембрану из полилозы ди фтора методом трансплота турбо. Заблокируйте мембрану с помощью блокирующего раствора, содержащего 5% обезжиренного молока и 0,2% tween 20 в PBS и помещенного в контейнер.

Инкубируйте мембрану с первичным мышиным моноклональным антителом и S3 в разведении один к 1000 и бета-актином при разведении один к 5000 в холодильной камере при температуре 4 градуса Цельсия. После инкубации добавьте козий антимышиный иммуноглобулин G, конъюгированный с пероксидазой хренской редьки, в разведении 1 к 5000 и определите методом хемилюминесценции. На этом этапе зафиксируйте трансфицированные клетки H-C-V-R-N-A с помощью метанола в течение 30 минут при температуре минус 20 градусов Цельсия для иммунофлуоресцентного анализа.

По окончании промойте клетки PB S3 раз после блокировки иммунофлуоресцентным анализом, блокирующим буфер, используйте кроличий поликлональный анти NS пять первичных антител и мышиный моноклональный анти DS RNA антитела J 2 в разведении от одного до 200 и инкубируйте в течение пяти часов до ночи в холодном помещении при температуре четыре градуса Цельсия. После инкубации промойте клетки PB S3 раз после первичного антитела. Затем добавьте козий антикроличий иммуноглобулин G 4 8 8 поликлональное вторичное антитело и козий анти музный иммуноглобулин 5 9 4 поликлональное вторичное антитело в разведении один к 1000 и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре на настольной качалке.

После промывки клеток PB S3 раз окрашивают ядра с помощью геркса и рассматривают с помощью флуоресцентного микроскопа. Следующая пластина наивного оттенка, 7,5 0,1 ячейки примерно в три раза по 10 на треть ячеек в лунке. Используя 96-луночный планшет на следующий день, выполните десятикратное серийное разведение бесклеточной культуральной супернатантной жидкости, собранной из трансфицированных клеток H-C-V-R-N-A, используя питательную среду, и инокулируйте в трех экземплярах в оттенок.

7,5 0,1 клетки Зафиксировать клетки через 72 часа после заражения с помощью метанола в течение 30 минут при температуре минус 20 градусов Цельсия после извлечения клеток из морозильной камеры аминоокрашивания на белок H-C-V-N-S five A с использованием ранее описанных условий с использованием флуоресцентного микроскопа. Подсчитайте NS пять, A положительных клеточных очагов в лунке с наибольшим разведением вируса и рассчитайте среднее количество очагообразующих единиц на миллилитр. Качество линеаризованной плазмиды ВГС оценивали методом гель-электрофореза.

H-C-V-D-N-A подвергали транскрипции in vitro полимеразы T seven RNA, в результате чего получали один продукт РНК с концентрацией 9,6 килооснований. R-T-Q-P-C-R Результаты показали, что вирус дикого типа эффективно реплицирует геном. Дикий тип продемонстрировал на 1-3 log более высокий уровень репликации генома по сравнению с вирусом с нулевым опросом.

Вирус дикого типа продуцировал белок NS 3, участвующий в расщеплении вирусного белка и репликации генома. Вирус дикого типа также экспрессировал NS 5, белок, NS 5, белок, и двухцепочечную РНК, локализованную в клеточной цитоплазме трансфицированных клеток дикого типа, что позволяет предположить, что измерения титра вируса активной репликации вируса показали, что вирус дикого типа является инфекционным и производит более 10 000 очагообразующих единиц на миллилитр инфекционной частицы через шесть часов после трансфекции. Как вирусы дикого типа, так и вирусы pole null имели сходную активность люциферазы, что указывает на сходный уровень трансинфекции на входе.

Однако РНК была транслирована через 48 и 96 часов после трансфекции. Вирус дикого типа продемонстрировал повышенный уровень репликации генома по сравнению с вирусом poll null. Вирус дикого типа также продуцировал вирусный белок NS 3.

Вирус Poll Null имел базовый уровень активности люциферазы, в то время как вирус дикого типа имел в два-три логарифма более высокий уровень репликации по сравнению с вирусом Poll Null Reporter. После освоения вирусологические анализы на гепатит TC могут быть проведены за две недели, если они выполнены правильно. После этой процедуры характерные штаммы HCV могут быть протестированы на животных модельных системах для исследования in vivo приспособленности и взаимодействия патогенов с хозяином.

Разработка инфекционной системы культивирования клеток ВГС открыла исследователям путь к изучению вириона, морфогенеза и этапов вирусного выхода из цикла репликации ВГС. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как проводить различные вирусологические анализы для характеристики различных стадий цикла репликации вируса гепатита С. Не забывайте, что работа с вирусом гепатита С может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты.