Новый метод для генерации и наблюдения хемилюминесценции в биологическом Окружение

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы предложить новый доклинический, интероперационный, хемилюминесцентный метод визуализации, который может обеспечить преимущества по сравнению с существующими оптическими методами с точки зрения отношения сигнал/шум и пределов обнаружения. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, которые не были доступны с помощью традиционных методов оптической визуализации во многих областях, связанных с биологическими науками. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она имеет высокое соотношение сигнал/шум и не требует мгновенного света и излучения.

Таким образом, мы обнаружили, что применение этого метода действительно распространяется на интероперационную визуализацию множественных заболеваний, включая рак, из-за высокого соотношения сигнал/шум, которое может предложить этот метод. Поскольку для этой техники не требуется падающий свет, проблем с поглощением падающего света не возникает. Кроме того, существует большой набор химических инструментов для функционализации молекулы хемилюминесцентного ядра.

Для начала процедуры приготовьте 100 микролитров стандартных растворов трис(бипиридина)рутения(II)хлорида в воде обратного осмоса. Затем соедините каждый стандарт со 100 микролитрами 25 миллимолярного раствора аммиачно-цериевой селитры в воде обратного осмоса на предметном стекле микроскопа. Откройте программное обеспечение для визуализации биолюминесцентного ридера и нажмите кнопку «Инициализировать».

В режиме визуализации убедитесь, что люминесцентность и фотография отмечены, а флуоресцентность снята. Установите время воздействия люминесценции, группирование, f/stop и параметры фильтра излучения. Установите время экспозиции фотографии, группирование и параметры f/stop.

Затем установите высоту объекта в соответствии с образцом, который будет изображен. Установите поле зрения на B для расстояния 14 см между камерой и предметным столиком образца. Покройте пол камеры визуализации биолюминесцентного считывателя в предметном столике черной строительной бумагой.

Затем поместите первое предметное стекло с каплей стандартной смеси на предметный столик так, чтобы капля была центрирована в зеленом перекрестии светового короба. Затем наполните пульверизатор на три унции специально изготовленного небулайзера раствором триэтиламина в соотношении 1:3 в соотношении 50/50 воды и этанола. Следите за тем, чтобы в аспирационной трубе не было пузырьков воздуха.

Поместите небулайзер в камеру для визуализации так, чтобы распылительная насадка была направлена на каплю, которую необходимо изобразить, не загораживая камеру для обзора капли. Убедитесь, что выключатель питания небулайзера и индикатор питания горят, магнитный тумблер выключен, а шнуры питания и пульта дистанционного управления не запутаны. Закройте горячие точки, такие как отметки на предметном стекле, небольшими кусочками черной строительной бумаги.

Поместите не менее 40 сантиметров дистанционного шнура небулайзера в камеру для визуализации. Аккуратно закройте дверцу камеры, не обжимая шнуры небулайзера. В программном обеспечении прибора нажмите «Получить», включите автосохранение и задайте путь к файлу данных.

Запустите последовательность визуализации. Когда затвор откроется со слышимым щелчком, трижды переключите тумблер небулайзера, чтобы распылить на образец три очереди раствора триэтиламина. Повторяйте процедуру с каждым стандартным предметным стеклом, чтобы определить минимальную обнаруживаемую концентрацию рутениевого визуализирующего агента.

Чтобы начать процедуру визуализации in vivo, приготовьте 100 микролитров раствора, содержащего от 8 до 33 наномолей трис(бипиридина)рутения(II)хлорида в фосфатно-солевом буфере. Приготовьте 25-миллимолярный водный раствор аммиачно-цериевой селитры. Далее внутривенно ввели 100 микролитров рутениевого средства визуализации в хвостовую вену здоровых мышей.

Принесите мышей в жертву через 10 минут после инъекции путем удушения углекислым газом. Удалите кожу с туловища с помощью Y-образного разреза, а затем удалите реберную дугу, чтобы обнажить сердце и легкие. Вырежьте выходное отверстие в правом предсердии и введите 20 миллилитров PBS через иглу 24-го калибра в левый желудочек.

Разрежьте кожу живота, чтобы обнажить почки и печень. Если интересующим органом является печень, почка или селезенка делают видимый продольный разрез через орган. Подготовьте новую последовательность изображений в программном обеспечении для биолюминесцентного считывателя.

Для визуализации всей брюшной полости поместите мышь в камеру визуализации так, чтобы открытая брюшная полость была обращена к камере, а голова была направлена к задней части инструмента. Центрируйте интересующий орган в перекрестии зеленого светового короба. Тщательно промойте пульверизатор и насадку из узла небулайзера, а затем заполните бутылку раствором аммиачно-цериевой селитры.

Поместите небулайзер в камеру визуализации так, чтобы распылительная форсунка была направлена на место визуализации. Убедитесь, что камера не застегнута, шнуры не запутаны и не менее 40 сантиметров удаленного шнура находятся в камере. Закройте камеру и начните последовательность визуализации.

Когда затвор открывается со щелчком, поверните переключатель три раза, чтобы распылить три очереди окислителя на место съемки. После визуализации снимите узел небулайзера и тщательно промойте распылительную форсунку, чтобы предотвратить кристаллизацию аммиачно-цериевой селитры. Для последующей визуализации отдельных органов и количественного определения извлеките мышь из прибора и иссеките внутренние органы, начиная с открытой полости тела.

Разрежьте кожу задней ноги, чтобы иссечь образцы мышечной ткани. Если интересующим органом является печень, почка или селезенка, разрежьте орган пополам в продольном направлении. Затем поместите орган на чашку Петри или лист черной строительной бумаги.

Визуализируйте каждый орган так же, как и все животное в целом, промывая распылительную форсунку после каждой последовательности. В ходе этой процедуры мышам вводили визуализирующий агент на основе рутения, а на интересующую ткань распыляли окислитель для индуцирования хемилюминесценции. Минимальная обнаруживаемая концентрация визуализирующего агента была определена как 6,9 пикомоле на квадратный сантиметр в этих условиях.

Хемилюминесцентные изображения в белом свете исследуемых органов были получены с помощью биолюминесцентного ридера. Сигнал хемилюминесценции преимущественно наблюдался в почках после внутривенного введения, что указывает на почечную элиминацию гидрофильного катиона трис(бипиридина)рутения(II). Соотношение сигнал/шум визуализирующего агента по сравнению с PBS составляло 27:1 в почках и 21:1 в печени.

Подколенные лимфатические узлы мышей также оценивали с помощью подкожного введения более концентрированного раствора визуализирующего агента на основе рутения. Лимфатические узлы, содержащие визуализирующий агент, показали значительно большее излучение, чем лимфатические узлы, содержащие только PBS. После освоения этой техники ее можно сделать за два часа, если ее правильно выполнить.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить об исключении окружающего света и избегать загрязнения рутением tris bpy. После своего развития этот метод проложит путь исследователям в области биомолекулярной визуализации для изучения болезненных состояний, таких как рак у мышей. Хотя этот метод может дать представление о вопросах, которые были недоступны с помощью традиционных методов оптической визуализации, любой вопрос, который можно было бы исследовать с помощью традиционных методов, потенциально может быть решен с помощью хемилюминесценции.