Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток
26 декабря 2016 г.
Определение новых мишеней для лекарств, которые переходят от доклинических испытаний к испытаниям на людях, является научным приоритетом. С этой целью мы описываем подход функциональной геномики для изучения влияния истощения генов на сфероиды раковых клеток, которые более адекватно моделируют рак человека in vivo.
Целью данного протокола скрининга миРНК является изучение влияния сайленсинга генов на рост сфероидов раковых клеток. По сравнению с традиционными методами двумерного культивирования клеток, раковые сфероиды демонстрируют условия, более похожие на те, которые встречаются при опухолях in vivo. Этот метод полезен для функциональной оценки часто измененных генов при раке человека, и, что более важно, он может быть использован для определения того, какие гены являются потенциальными онкогенами или супрессорами опухолей в более сложных условиях культивирования, таких как наблюдаемые в трехмерной культуре, и, в частности, при гипоксии.
Основное преимущество этого метода заключается в том, что он легко адаптируется, так что исследователи могут использовать его для изучения своих конкретных генов, представляющих интерес в предпочитаемых ими клеточных линиях. Мы считаем, что он основан на существующих подходах к таргетному скринингу sRNA. Общепризнано, что целевой скрининг, а не целые штаммы генома, позволяет ученым задавать конкретные вопросы и получать более надежные результаты.
Мы проанализировали влияние сайленсинга генов на жизнеспособность и размер сфероида, но вы также можете использовать биометрические красители для другого считывания показаний экрана, например, для апоптоза. Демонстрацию процедуры проводит Пэтти Вай из нашей лаборатории. Начните с размораживания 96-луночных планшетов, содержащих библиотеку миРНК, при комнатной температуре.
Затем вращайте в течение пяти минут со скоростью 1000 раз g, используя настольную центрифугу. С помощью многоканальной пипетки добавьте 10 микролитров восстановленной сывороточной среды, содержащей оптимизированный реагент для трансфекции, в лунки каждой пластины. Инкубируйте в течение 15 минут, чтобы образовались трансфекционные комплексы, содержащие миРНК.
Как и в случае с любым конвейером скрининга, способность клеточных линий к образованию сфероидов в условиях трансфекции должна быть надежно оптимизирована до проведения полного скрининга. Затем трипсинизируйте клетки, подлежащие скринингу, до тех пор, пока они не отсоединятся от колбы. После того, как клетки отделятся, нейтрализуйте трипсин соответствующим объемом среды, специфичной для клеточной линии, перенесите в центрифужную пробирку и вращайте в течение пяти минут при давлении 1000 раз больше g в настольной центрифуге для сбора клеток.
Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу в одноклеточную суспензию с соответствующим объемом среды. Выполните подсчет ячеек с помощью автоматического счетчика ячеек. Затем разбавьте суспензию до 5 000 клеток на 180 микролитров холодной средой.
Перенесите клеточную суспензию в резервуар. С помощью многоканальной пипетки, установленной на уровне 180 микролитров, пипеткой перемешать и перенести клеточную суспензию на 96-луночный планшет, содержащий миРНК. Центрифугируйте планшет при 1000 g в предварительно охлажденной центрифуге при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут, а затем инкубируйте планшет в инкубаторе для культуры тканей при температуре 37 градусов Цельсия.
На этом этапе ячейки будут выглядеть как мозаика на дне лунок. Через 24 часа понаблюдайте за клетками под микроскопом. На этом этапе ячейки должны быть объединены вместе, чтобы сформировать единый сфероид в центре лунки.
Добавьте 100 микролитров готовой среды в каждую лунку, чтобы стимулировать рост, прежде чем вернуться в инкубатор. После трех дней роста аккуратно удалите по 100 микролитров среды из каждой лунки, и добавьте 100 микролитров свежей среды. На седьмой день исследуйте сфероиды под микроскопом, а затем приступайте к количественной оценке размера сфероида на планшетном ридоре, который может количественно отслеживать рост сфероидов с течением времени.
Чтобы количественно определить размер сфероида, сначала откройте программное обеспечение на компьютере. Выберите 96-луночный планшет, выберите подходящий тип планшета и введите название эксперимента. Затем вставьте 96-луночный планшет, содержащий сфероиды, в настольный микролуночный планшетный цитометр.
Далее выберите приложение Tumorsphere. Выберите фокус на основе изображения, чтобы изменить фокус таким образом, чтобы сфероид был в фокусе и имел оптимальный контраст. Выберите скважины, требующие сканирования, и приступайте к сканированию.
Затем убедитесь, что маска объекта точно отражает размер сфероида. Для сфероидов BT474, выращиваемых в течение семи дней, установите Точность на Высокую и установите минимальный диаметр колонии на 200 микрон. Используйте функцию Экспорт для экспорта данных в виде аннотированного файла данных, который будет проанализирован для выявления миРНК со статистически значимым влиянием на площадь сфероида.
После визуализации удалите по 100 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 100 микролитров люминесцентного красителя для определения жизнеспособности клеток. После инкубации планшетов в течение 15 минут отсканируйте планшет с помощью люминесцентного считывателя пластин. Этот протокол также может быть адаптирован для использования с другими линиями раковых клеток.
Процедура обратной трансфекции контрольной группы, не являющейся мишенью, существенно не влияла на жизнеспособность ни одной из протестированных линий, в то время как трансфекция убиквитина В, положительного контроля для уничтожения клеток, значительно снижала жизнеспособность. Клетки BT474 подвергали обратной трансфицации библиотекой миРНК человеческого siGENOME с 200 генами в трех экземплярах. Наблюдалась площадь сфероида и жизнеспособность.
Были выявлены значимые выбросы с z-оценкой более 1,7. СиРНК, которые значительно увеличивают или уменьшают площадь сфероидов и жизнеспособность, затенены синим цветом, а красным цветом обозначены контрольные миРНК. Этот набор микрофотографий показывает репрезентативные изображения сфероидов BT474 через семь дней после обратной трансфекции миРНК E-Cadherin, нецелевого контроля, PIK3CA, ERBB2 или SF3B1.
Эта гистограмма показывает, как обработка каждой миРНК повлияла на жизнеспособность клеток через семь дней после обратной трансфекции. Нокдаун ERBB2 и PIK3CA значительно снижал жизнеспособность клеток по сравнению с контрольной группой. Это изображение демонстрирует, что сфероиды могут быть успешно иммуноокрашены, чтобы выявить влияние сайленсинга генов на целевые белки.
После освоения несколько сотен генов могут быть проверены в нескольких клеточных линиях за один день, и это позволяет надежно идентифицировать потенциально новые гены, важные для выживания в трехмерной культуре. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как успешно культивировать сфероиды раковых клеток, которые поддаются сайленсингу генов, опосредованному sRNA. Вы также сможете исследовать влияние сайленсинга генов, выполнив иммуногистохимию на сфероиды.
Это может дать ценную пространственную информацию, которая может помочь вам узнать о лежащей в основе биологии.
Обзор
В данной статье представлен подход функциональной геномики для идентификации потенциальных мишеней лекарственных препаратов путем изучения эффектов делеции генов в сфероидах клеточных линий рака. Эти сфероиды обеспечивают более точную модель опухолей человека in vivo по сравнению с традиционными 2D-культурами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Функциональная геномика
- Биология рака
- Методы культивирования клеток
Теоретические основы
- Сайленсинг генов позволяет выявить онкогены и супрессоры опухолей.
- Сфероиды раковых клеток более точно имитируют микроокружение опухоли, чем 2D-культуры.
- Таргетный скрининг с помощью siRNA позволяет проводить специфическое исследование генов.
- Данный метод позволяет изучать условия гипоксии.
Цель исследования
- Изучить влияние сайленсинга генов на рост раковых сфероидов.
- Идентифицировать гены, которые могут служить новыми мишенями для лекарственных препаратов.
- Углубить понимание функций генов в условиях 3D-культивирования.
Используемые методы
- скрининг siRNA в сфероидах клеточных линий рака.
- оптимизация условий трансфекции для стабильного формирования сфероидов.
- количественная оценка размера и жизнеспособности сфероидов с помощью имидж-цитометрии.
- анализ влияния сайленсинга генов на жизнеспособность и рост клеток.
Основные результаты
- Были отмечены значимые эффекты специфических сиРНК на жизнеспособность и размер сфероидов.
- Нокдаун ERBB2 и PIK3CA привел к снижению жизнеспособности клеток по сравнению с контролем.
- Была достигнута надежная идентификация генов, важных для выживания в 3D-культуре.
- Была продемонстрирована адаптивность метода для различных линий раковых клеток.
Выводы
- Данный подход позволяет проводить скрининг сотен генов за один день.
- Он представляет собой ценный инструмент для выявления потенциальных терапевтических мишеней при раке.
- Этот метод расширяет понимание функций генов в более физиологически релевантном контексте.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Скрининг функциональной геномики в 3D-моделях раковых сфероидов улучшает валидацию мишеней, выявляя генные зависимости в физиологически релевантных условиях. Этот подход повышает прогностическую достоверность при идентификации новых мишеней для лекарственных препаратов, поскольку учитывает влияние микроокружения опухоли, которое часто упускается в 2D-культурах. Данный метод способствует принятию решений на ранних этапах поиска, связывая эффекты сайленсинга генов с ростом и жизнеспособностью сфероидов, что позволяет снизить механистические риски при выборе потенциальных мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем оценки влияния сайленсинга генов на рост и жизнеспособность раковых сфероидов.
- Практическая ценность: Возможность функционального анализа часто изменяемых генов при раке человека в условиях сложных культур.
- Прогностическая ценность: Выявление потенциальных онкогенов или супрессоров опухолей, критически важных для выживания в 3D-культуре, что способствует приоритизации мишеней.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: использование скрининга с помощью siRNA для получения количественных данных о площади и жизнеспособности сфероидов с целью анализа эффекта генов.
- Практическая ценность: необходимость оптимизации условий трансфекции и способности к формированию сфероидов для обеспечения надежных и воспроизводимых результатов скрининга.
- Готовность анализа: применение имиджин-цитометрии и люминесцентных красителей для оценки жизнеспособности, что позволяет осуществлять высококонтентный количественный мониторинг роста сфероидов во времени.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: подтверждает пространственное влияние генных зависимостей с помощью иммуногистохимии, связывая молекулярные результаты с изменениями на уровне белков в сфероидах.
- Доклиническая преемственность: демонстрирует зависимость от амплификации HER2 и мутации PIK3CA в сфероидах BT474, подтверждая роль известных драйверов рака в 3D-модели.
- Механистическое снижение рисков: обеспечивает пространственную и функциональную валидацию эффектов генов, уменьшая неопределенность в механизме действия мишени перед дальнейшими инвестициями.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки лекарств — от идентификации мишени до оптимизации соединений-лидеров, что особенно актуально для мишеней, требующих валидации в сложных моделях опухолей, склонных к развитию гипоксии.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей путем установления связи между нокдауном генов и изменениями жизнеспособности и размера сфероидов.
- Скрининг: позволяет стандартизировать анализ за счет использования протоколов обратной трансфекции и стандартизированного формирования сфероидов в 96-луночных форматах.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных о площади и жизнеспособности сфероидов с помощью имиджингового цитометра и люминесцентного считывания, что позволяет статистически идентифицировать значимые результаты (например, z-score >1.7).
- Трансляционные исследования: связывают эффекты сайленсинга генов с пространственной экспрессией белков с помощью иммуногистохимии, улучшая согласование биомаркеров и понимание механизмов.
- Корпоративное повторное использование: метод адаптируем для различных линий раковых клеток и библиотек siRNA, что позволяет использовать его в качестве многократной платформы для кампаний по валидации мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет выявления генных зависимостей в релевантном для опухоли 3D-контексте.
- Операционная ценность: Способствует воспроизводимости благодаря стандартизированному формированию сфероидов, оптимизации трансфекции и рабочим процессам количественной визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет сокращения числа ложноположительных результатов, характерных для 2D-моделей, и повышения уверенности в существенности мишени.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе функциональных данных, полученных из физиологически релевантных моделей.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с культурами клеток, методы трансфекции и опыт работы с 3D-моделями для обеспечения стабильного формирования сфероидов.
- Процесс зависит от наличия доступ к проточной цитометрии с визуализацией и люминесцентным планшетным ридерам для количественной оценки размера и жизнеспособности сфероидов.
- Необходима оптимизация условий трансфекции и плотности клеток (5,000 cells/180 µL) для единообразного формирования сфероидов в лунках.
- При расширении исследования на другие линии раковых клеток или условия с модулированной гипоксией потребуются соответствующие адаптационные меры.
- Практическое ограничение: пропускная способность скрининга зависит от размера библиотеки siRNA и возможностей визуализации, хотя после оптимизации в день можно проверять сотни генов.
