Визуализация Cell Shape Переоборудование и Cell движения в Drosophila гаструляцией Использование DE-кадгерин Reporter Трансгенные Мухи
29 декабря 2016 г.
Здесь мы описываем процедуру получения живых изображений гаструляции дрозофилы. Это позволило нам лучше понять апикальную констрикцию, связанную с ранним развитием, и дополнительно проанализировать механизмы, управляющие клеточными движениями во время модификации структуры ткани.
Общая цель этой процедуры, состоит в том, чтобы лучше понять форму и движение клеток во время гаструляции дрозофилы. Здесь мы предлагаем робустический метод измерения гаструляции дрозофилы, чтобы оценить начало морфогенетического клеточного движения на этой стадии эмбрионального развития. Основное преимущество этой методики заключается в том, что перестройка клеток во время гаструляции может быть идентифицирована наряду с апикальной констрикцией во время гаструляции.
Для начала эксперимента приготовьте смесь из 375 миллилитров воды. 125 миллилитров 100% имеющегося в продаже яблочного сока. 12,5 грамм агара.
12,5 грамм глюкозы. Далее нагрейте смесь в микроволновой печи, пока агар не расплавится. И высыпаем его в трехсантиметровую посуду для клеточных культур.
Хранить смесь при температуре 4 градуса Цельсия, впрок. После подготовки яблочной тарелки добавьте поверх нее тонкий слой размятой дрожжевой пасты, чтобы дать возможность мухам отложить яйца. Поместите 25 самцов и 25 самок мух в бутылку на яблочную тарелку, покрытую размятыми дрожжами.
Оберните пластиковые бутылочки дрозофил алюминиевой фольгой, чтобы побудить мух отложить больше яиц. Храните флакон в перевернутом виде в инкубаторе на ночь. На следующее утро замените тарелку с яблочным соком на свежую.
Затем оберните бутылку алюминиевой фольгой и дайте мухам отложить яйца в течение трех-четырех часов. После того как мухи отложили яйца, отсоедините яйца от тарелки ватной палочкой. Соберите эмбрионы в ситечко и промойте их фосфатным буферным раствором или PBS.
Промойте зародыши еще три раза PBS, в 12-луночной посуде для культивирования. Дехорионат эмбрионов с помощью 50% отбеливателя в 12-луночных чашках для культивирования. Следуя за процессом дехорионации, промойте эмбрионы еще три раза PBS.
Перенесите эмбрионы в трехсантиметровую чашку для клеточных культур, содержащую PBS. И отбирать эмбрионы пятой стадии под микроскопом, исходя из уровня прозрачности на их границах. С помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров соберите стадированные эмбрионы.
Далее поместите два выбранных эмбриона на стеклянную крышку, а излишки PBS удалите папиросной бумагой. С помощью тонко скрученной папиросной бумаги ориентируйте эмбрионы тыльной стороной вверх к покровному листу. Затем приложите зародыши к стеклянной крышке слипом с силиконовой смазкой с помощью тонкой иглы.
Добавьте небольшую каплю полого углеродного масла 700 на эмбрионы и положите покровную крышку с эмбрионами вверх ногами на углубленное стекло. Оставляем немного места в нижней части горки. Затем приклейте защитный листок к слайду.
Наконец, исследуйте эмбрионы с помощью системы конфокальной визуализации, лазера на аргоне 488 и объектива для погружения в масло. Покадровые изображения были получены с помощью визуализации в реальном времени с использованием DE-cadherin GFP движения клеток в течение 500 секунд для анализа апикальных областей отдельных клеток дрозофилы во время гаструляции. Через 500 секунд отчетливо заметны апикальное сужение и инвагинация.
Используя наш метод. Мы можем также понять молекулярные механизмы гаструляции дрозофилы, а также переход от эпителия к мезенхимале, участвующий в метастазировании рака.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена методика получения изображений живых клеток в процессе гаструляции Drosophila, что расширяет наше понимание механизмов апикальной констрикции на ранних стадиях развития. Данный метод позволяет детально проанализировать клеточные перемещения, участвующие в модификации структуры тканей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биология развития
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Гаструляция Drosophila является критическим этапом эмбрионального развития.
- Понимание формы и перемещения клеток имеет важное значение для осмысления процессов развития.
- Апикальная констрикция играет значительную роль в морфогенетических движениях.
- Методы визуализации живых объектов позволяют получить представление о динамике поведения клеток.
Цель исследования
- Углубление понимания клеточных перемещений в процессе гаструляции Drosophila.
- Разработка надежного метода измерения морфогенетических перемещений клеток.
- Идентификация перестроек клеток и апикальной констрикции во время гаструляции.
Используемые методы
- Приготовление специальной смеси для визуализации.
- Визуализация живых эмбрионов Drosophila в процессе гаструляции.
- Анализ перемещений клеток и изменений их формы.
- Идентификация ключевых морфогенетических событий.
Основные результаты
- Успешное получение прижизненных изображений гаструляции Drosophila.
- Идентификация апикальной констрикции и перестройки клеток.
- Углубленное понимание клеточной динамики в ходе раннего развития.
- Надежная методология для дальнейших исследований в области биологии развития.
Выводы
- Данная процедура дает ценную информацию о гаструляции Drosophila.
- Визуализация живых объектов является мощным инструментом для изучения клеточных перемещений.
- Полученные результаты способствуют более широкому пониманию процессов развития.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация в реальном времени изменений формы и перемещения клеток во время гаструляции Drosophila представляет собой надежную платформу для анализа молекулярных механизмов, лежащих в основе эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) — процесса, связанного с фиброзом и метастазированием рака. Данный метод позволяет с высоким разрешением визуализировать апикальную констрикцию и перестройку клеток, что обеспечивает высокую прогностическую достоверность при валидации мишеней на ранних стадиях для путей, связанных с ЭМП. Такой подход укрепляет трансляционную преемственность от биологии развития к изучению механизмов заболеваний в рамках биофармацевтических исследований и разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать функции генов, связанных с ЭМП, и динамику соответствующих сигнальных путей в живом многоклеточном контексте.
- Способствует снижению биологических рисков за счет прямой визуализации морфогенетических событий, связанных с механизмами заболеваний.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней для генов, контролирующих апикальную констрикцию и переходы в судьбе клеток.
- Повышает прогностическую уверенность при приоритизации мишеней, модулирующих ЭМП, в портфелях препаратов для лечения онкологии и фиброза.
Скрининг и разработка анализа
- Создает валидированную систему визуализации для количественной оценки перемещения клеток и изменений их формы в режиме реального времени.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение апикальной констрикции и перестройки клеток в качестве количественных результатов анализа.
- Способствует стандартизации платформ фенотипического скрининга соединений, модулирующих ЭМП.
- Позволяет подготовить надежные биологические системы для последующих рабочих процессов высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет процессы эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) в развитии с соответствующими моделями метастазирования и ремоделирования тканей при заболеваниях.
- Предоставляет понимание механизмов, которое служит основой для выбора трансляционных биомаркеров для доклинических исследований.
- Обеспечивает продвижение кандидатов, нацеленных на ЭМП, с учетом рисков на основе данных о фенотипе живых клеток.
- Укрепляет преемственность от этапа открытия до доклинической валидации в областях заболеваний, обусловленных ЭМП.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод визуализации интегрируется в континуум научных исследований: от первоначальной проверки гипотез до разработки доклинических моделей для мишеней, связанных с ЭМП.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей воздействия регуляторов ЭМП и морфогенеза.
- Скрининг: Предоставляет количественные, воспроизводимые данные о форме и движении клеток, что позволяет подготовить метод к анализу.
- Аналитика: Обеспечивает получение данных высококонтентной визуализации для сравнительного анализа генетических или фармакологических воздействий.
- Трансляционные исследования: Связывает механизмы развития с релевантными для заболеваний моделями ЭМП для согласования биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает многократно используемую платформу визуализации, адаптируемую для различных исследований ЭМП и морфогенеза.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и способствует снижению механистических рисков для программ по поиску мишеней, направленных на ЭМП.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, масштабируемые рабочие процессы визуализации для воспроизводимости результатов между различными проектами.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях при работе с показаниями, связанными с ЭМП.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию активов, модулирующих ЭМП, в различных терапевтических областях с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых объектов, конфокальной микроскопии и эмбриологии Drosophila.
- Необходим доступ к современному оборудованию для визуализации и аналитическому программному обеспечению для таймлапс-анализа.
- Для обеспечения воспроизводимости необходима межгрупповая стандартизация протоколов стадирования эмбрионов и визуализации.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации репортерных конструкций и условий визуализации.
- Практические ограничения включают ограниченную пропускную способность и необходимость точного обращения с эмбрионами.
