Развитие прямого Pulp-укупорки модель для оценки пульпозного ранозаживляющим и Репаративная дентина Формирование у мышей

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы представить процедуру прямого укупорки пульпы у мышей. Этот метод может помочь вам ответить на ключевые вопросы биологии пульпы, такие как заживление пульпы или как образуется репаративный дентин, когда вы помещаете захваченные материалы пульпы на обнаженную пульпу. Основное преимущество этого метода заключается в том, что фактическая процедура прямого укупоривания пульпы, выполненная у людей, может быть выполнена и на мышах, точно таким же образом.

Применение этого метода распространяется на улучшение свойств материала для сохранения зубов, которые в противном случае обречены на более инвазивные методы лечения, такие как лечение корневых каналов. После надлежащей анестезии мыши перед процедурой поместите держатель рта в ее рот, а другой конец закрепите на столе так, чтобы голова была обращена вверх. Используя хорошее освещение и стереоскоп, понаблюдайте за первым верхнечелюстным коренным зубом.

Затем с помощью четвертькруглого бора в высокоскоростном наконечнике со скоростью 200 000 об/мин удалите центральную область зубной эмали до тех пор, пока пульпа не станет видна через прозрачный дентин. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть внутрь мякоти. Далее, используя no.

15 Эндодонтический файл K-File, перфорировать через дентин и обнажить пульпу. Не проталкивайте мусор в мякоть; Этого можно избежать, поворачивая K-файл ежеквартально, а затем вытаскивая K-файл. Теперь подготовьте MTA и с помощью проводника доставьте MTA, затем упакуйте его в открытую область, используя обратную сторону бумажной точки и осторожно постукивая.

Затем с помощью шприца, загруженного 35% этрантом фосфорной кислоты, накройте зуб травлетом, избегая десневых тканей, и дайте травлению подействовать в течение 15 секунд. Через 15 секунд отсосите травление от зуба и с помощью ватного аппликатора, смоченного водой, сотрите остатки травла. Отсосите и протрите, пока не будет удален весь трав.

Затем нанесите стоматологические клеи с помощью обратной стороны бумажного наконечника. Сделайте слой клея тонким, продув его сжатым воздухом в течение нескольких секунд. Затем отверждайте клей в течение 30 секунд при подходящем свете.

Теперь нанесите небольшое количество композита на зуб с помощью кончика проводника, чтобы ввести композит в канавки зубьев. После нанесения полимер отверждается в течение 30 секунд. После усыпления мыши и удаления всей верхней челюсти поместите челюсть в 4% параформальдегид в PBS при pH 7,4.

Храните салфетку при температуре 4 градуса Цельсия в течение ночи, а на следующее утро перенесите ее на 70% этанол для хранения до тех пор, пока ее можно будет обработать. Чтобы сделать микрокомпьютерную томографию верхней челюсти, сначала заверните ее в марлю, смоченную 70% этанолом, а затем упакуйте в 15-миллилитровую пробирку для клеточных культур. Затем установите трубку на столик для микрокомпьютерной томографии.

Затем настройте источник рентгеновского излучения на подачу тока 145 микроампер с пиковым напряжением 55 киловольт в течение 200 миллисекунд. С помощью алюминиевого фильтра 0,5 миллиметра можно получать изображения с разрешением 20 микрон. После завершения сканирования начните декальцификацию верхней челюсти с помощью 5% ЭДТА и 4% сахарозы в PBS при pH 7,4.

Дайте такой реакции идти две недели при температуре 4 градуса Цельсия. После заделки верхней челюсти сделайте ломтики толщиной пять микрон. Участки укупорки пульпы обычно совпадают с дистальным небным корнем, который можно использовать в качестве ориентира.

Определите точную область интереса, изучив гистологию под световым микроскопом и сравнив результаты с микрокомпьютерной томографией. Для окрашивания H&E удалите парафин и увлажните предметные стекла двумя ваннами в ксилоле в течение нескольких минут каждая. Затем пропустите их через ряд последовательно разбавленного этанола.

Каждая ванна должна применяться всего на одну минуту. После регидратации прополощите жидкость. А затем нанести раствор гемотоксилина на две с половиной минуты.

Удалите краситель с помощью полоскания, а затем поместите горки в 95% этанол на одну минуту. Далее испачкайте горки раствором эозина в течение одной минуты, а затем смойте их. Поверните вспять этапы гидратации, чтобы обезвоживать испачканные ткани, начиная с этанола.

Затем обработайте их ксилолом. Затем слайды можно монтировать и визуализировать. С использованием описанных процедур пульп-кэппинг проводили на 8-недельных мышах.

Шесть недель спустя у них были собраны и исследованы верхние челюсти. Любопытно, что окрашивание H&E выявило образование дентина по всей пульповой камере и корневым каналам. Для сравнения, на незакрытом моляре не было такого же образования дентина.

В закрытом моляре наблюдались характеристики как дентиноподобного, так и костеподобного образования, поскольку в репаративном дентине были обнаружены как дентинные канальцы, так и остеоциты, что позволяет предположить, что поврежденная пульпа может быть минерализована как резидентными одонтобластами, так и иммигрировавшими остеобластами. Использование иммуногистохимического окрашивания DMP1 дополнительно подтвердило повышенную активность клеток, образующих репаративный дентин. Как и в реальной стоматологической клинической практике, наличие ассистента чрезвычайно полезно.

Например, с помощником эту технику можно проделать всего за десять минут, как только она будет освоена. Важно отметить, что при обнажении пульпы не забывайте использовать эндофил, а не бор. И когда вы вручаете MTA, будьте осторожны.

Не забывайте, что работа с фиксаторами, такими как параформальдегид, может быть чрезвычайно опасной. Всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.