Xenopus ооциты: Оптимизированные методы микроинъекции, Удаление тироцит слоев и быстрые изменения в Решение электрофизиологических экспериментов

Общая цель этой процедуры заключается в экспрессии новых белков, таких как ионные каналы в ооцитах Xenopus. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в любой области, требующей функциональной системы выражения. Основными преимуществами вариаций этой методики являются скорость, надежность и повышенная выживаемость ооцитов.

Этот метод может дать представление о функционировании ионных каналов. Кроме того, он может быть применен для исследования любого другого белка. Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы поняли, что классические методы приводят к низкому уровню выживаемости ооцитов.

После удаления долей яичников у самок лягушек согласно текстовому протоколу поместите доли в стерильный модифицированный раствор Барта с добавлением пенициллина и стрептомицина. Разрежьте доли, чтобы обеспечить доступ тканей к кислороду. Чтобы выделить фолликулы пятой-шестой стадии, используйте щипцы для удержания яичника, а затем опустите платиновую петлю над фолликулами и аккуратно вытащите петлю, чтобы разрушить соединительную ткань с фолликулом из ткани яичника.

Отсортируйте здоровые на вид ооциты с помощью платиновой петли. С помощью пластиковой пастеровской пипетки с отрезанным до диаметра 1,5 миллиметра кончиком перенесите выбранные фолликулы в чашку Петри диаметром 35 миллиметров. После подготовки кРНК для рецептора ГАМК А и пипеток для микроинъекций в соответствии с текстовым протоколом используйте парафиновое масло и шприц объемом 10 миллилитров с тонкой иглой для заполнения пипетки для микроинъекций.

Затем установите пипетку на самодельный аппарат для микроинъекций. С помощью пипетки со стерильным пластиковым наконечником поместите каплю раствора мРНК на чистую сторону куска влагостойкого термопластика. Затем погрузите кончик инъекционной пипетки в каплю и включите мотор, чтобы втянуть поршень.

Раствор мРНК должен входить в пипетку и образовывать видимую границу раздела с маслом. Затем отведите кончик пипетки от капли и надавите на внутреннюю часть пипетки для инъекций. На кончике пипетки для инъекций должна образоваться капля раствора мРНК.

С помощью 60-миллиметровой чашки Петри с приклеенной на дно нейлоновой сеткой и покрытой MBS для инъекций выровняйте фолликулы так, чтобы их вегетативные полюса были направлены вверх. С помощью микроманипулятора расположите инъекционную пипетку над отдельным фолликулом. Введите иглу для инъекции в центр вегетального столба и надавите на внутреннюю часть пипетки, чтобы ввести 50 нанолитров мРНК со скоростью потока 0,6 микролитра в минуту.

Подождите от 5 до 10 секунд, прежде чем извлекать наконечник пипетки для инъекции из фолликула, чтобы избежать утечки матричной РНК. Перенесите введенные фолликулы в новую чашку Петри, наполненную двумя миллилитрами МБС. Поместите блюдо в винный холодильник, установленный на 18 градусов по Цельсию.

Инкубируйте введенные фолликулы в течение от одного до семи дней до записи, в зависимости от идентичности вновь экспрессированного белка. Чтобы стрипировать фолликулы, перенесите десять введенных фолликулов в боросиликатную стеклянную трубку, содержащую 0,5 миллилитра МБС, один миллиграмм на миллилитр коллагеназы и 0,1 миллиграмм на миллилитр ингибитора трипсина. Погрузите трубку в водяную баню с температурой 36 градусов Цельсия и инкубируйте фолликулы в течение 20 минут.

Температура здесь критическая, потому что еще один градус может убить ооциты. Промойте фолликулы, перенеся их во вторую пробирку, содержащую один миллилитр MBS комнатной температуры, и оставьте их в пробирке примерно на десять секунд. Затем перенесите фолликулы в третью пробирку, содержащую 0,5 миллилитра двуконцентрированного МБС, содержащего четыре миллимоляра EGTA, и инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение четырех минут, периодически встряхивая пробирки.

Время инкубации в четыре минуты имеет решающее значение для того, чтобы фолликулярные слои отделились от ооцита. Промойте фолликулы, перенеся их в другую пробирку, содержащую один миллилитр MBS комнатной температуры, и оставьте их в пробирке примерно на 10 секунд. Перенесите ооциты в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитра МБС.

Затем под стереомикроскопом используйте платиновую петлю, чтобы отделить внешние оболочки от фолликулов, просто оттолкнув голый ооцит. Храните оголенные ооциты до использования. В этом эксперименте механически выделенным ооцитам Xenopus вводили микроинъекцию покрытия мРНК для субъединиц рецептора ГАМК А.

Затем были удалены слои фолликулярных клеток. Ооциты были ограничены напряжением при отрицательном напряжении 80 мВ и подвергались воздействию возрастающих концентраций ГАМК и присутствия THDOC, мощного положительного аллостерического модулятора рецептора ГАМК А. На этой панели показаны вызванные амплитуды тока в зависимости от концентрации ГАМК, что указывает на чувствительность этой комбинации субъединиц к ГАМК.

Использовалось уравнение I(c)Imax/n), где c — концентрация ГАМК, EC50 — концентрация ГАМК в присутствии одного микромолярного THDOC, вызывающего половину максимальной амплитуды тока. Imax - максимальная амплитуда тока. I — амплитуда тока, а n — коэффициент Хилла.

EC50 альфа-четырех бета-двух дельта-рецепторов ГАМК А составил 0,41-0,12 микромоля, а n - 0,76-0,04. После освоения слои фолликулальных клеток могут быть удалены за полчаса при правильном выполнении. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей к улучшению процедуры экспрессии белка в ооцитах Xenopus. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать ооциты Xenopus в окружении слоев фолликулярных клеток, их микроинъекцию мРНК и последующее удаление слоев фолликулярных клеток.