Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis
24 января 2017 г.
Мы установили способ очистки coregulatory взаимодействия белков с использованием системы LC-MS / MS.
Общая цель этой процедуры заключается в идентификации белков, взаимодействующих с ядерным кофактором, с помощью LC-MS/MS Analysis. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с транскрипционными механизмами в области регуляции генов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем идентифицировать белки, взаимодействующие с ядерным кофактором.
Более того, этот метод позволяет нам лучше понять механизмы транскрипционной регуляции целевых ядерных факторов. Соберите HEK 293 клетки, экспрессирующие помеченный флагом ARIP4, через 36 часов после трансвекции, промыв клеточный лист ледяным PBS и собрав клетки с помощью скребка клеток. Переложите клетки в пробирку объемом 1,5 миллилитра, а затем центрифугируйте при плотности 8000 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.
Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в объеме, в пять раз превышающем объем гранул буфера с высоким содержанием солей. Вращайте смесь в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После 20 минут вращения центрифугируйте пробирку при 17 700 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Далее переложите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую пробирку и добавьте буфер для разведения до трехкратного объема надосадочной жидкости. Проведите еще одну цетрифугацию, а затем переложите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую трубку. Во время 10-минутного центрифугирования промойте 50 микролитров шариков против флага с PBS.
Затем центрифугируйте пробирку при 2000 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторите шаги промывания сначала 1 моляром гидрохлорида глицина, а затем одним моляром трис гидрохлоридом. Затем дважды постирайте с буфером с низким содержанием соли.
Далее смешайте 50 микролитров промытых шариков с экстрактами целых клеток. Аккуратно вращайте смесь в течение четырех часов при температуре от двух до четырех градусов Цельсия. Затем с помощью затупленного кончика перенесите образец в микроспиновую колонку и дайте раствору просочиться в пробирку объемом 1,5 миллилитра.
Заморозьте поток в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Далее промойте бусины флажка с буфером с низким содержанием соли пять раз. Чтобы сделать элюирование, поместите колонку в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при плотности 2000 г в течение одной минуты, чтобы высушить шарики.
Закройте крышкой дно колонки, а затем добавьте 50 микролитров 1 моляра глицина гидрохлорида. Аккуратно встряхивайте смесь в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут поместите колонку в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при плотности 2000 г в течение одной минуты.
Нейтрализуйте элюированный раствор 10 микролитрами одного моляра трис гидрохлорида и хорошо перемешайте путем пипетирования и вортексирования. Добавьте 50 микролитров 100 миллимолярного бикарбоната аммония. 10 микролитров ацетонитрила, два микролитра дитиотреитола и 50 микролитров нейтрализованного образца.
Выдерживать в течение 30 минут при температуре 56 градусов по Цельсию. После инкубации оставьте образец при комнатной температуре на 10 минут. Затем добавьте в образец 10 микролитров 333 миллимоларного йодоацетамида и инкубируйте в темноте в течение 30 минут при 37 градусах С. Добавьте в смесь 10 микролитров трипсина и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия.
На следующий день готовый продукт транспортируется на установку ЖХ-МС/МС или в стороннюю лабораторию масс-спектрометрии для анализа. На этом изображении показано серебряное окрашивание меченого флагом эпитопа ARIP4, экспрессирующегося в клетках HEK 293 после иммунного осаждения специфическим антителом и разделения с помощью электрофореза. В качестве контроля была проведена имитационная очистка клеток HEK 293, которые не экспрессировали экзогенные белки.
Используя наш метод, можно идентифицировать предполагаемые ядерные кофакторы по интересующему их транскрипционному фактору и еще больше углубить наше понимание механизмов регуляции транскрипции.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол идентификации белков, взаимодействующих с ядерными кофакторами, с помощью анализа LC-MS/MS. Метод включает иммунопреципитацию ядерного кофактора с флаг-тегом из клеток HEK 293 с последующей масс-спектрометрией для выявления белок-белковых взаимодействий, имеющих значение для регуляции транскрипции. Данный подход позволяет исследователям расшифровать сложные сети, управляющие экспрессией генов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная биология
- Протеомика
- Транскрипционная регуляция
Теоретические основы
- Транскрипционные корегуляторы необходимы для эффективного регулирования структуры ядерного хроматина.
- Корегуляторы взаимодействуют с транскрипционными факторами, модифицируют гистоны и белки и могут изменять конформацию хроматина.
- Понимание белок-белковых взаимодействий в этих сетях имеет решающее значение для расшифровки механизмов регуляции генов.
- ЖХ-МС/МС является валидированным методом идентификации белков-партнеров по связыванию.
Цель исследования
- Разработать быстрый и надежный метод идентификации белков, взаимодействующих с ядерными кофакторами.
- Обеспечить возможность высокопроизводительного анализа белковых комплексов, участвующих в транскрипционной регуляции.
- Углубить понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе контроля экспрессии генов.
Используемые методы
- Экспрессия ARIP4 с flag-меткой в клетках HEK 293.
- Сбор клеток и лизис с использованием высокосолевого буфера.
- Иммунопреципитация с использованием анти-flag бусин для изоляции белковых комплексов.
- Последовательная промывка и элюция связанных белков.
- Переваривание белков трипсином и подготовка образцов для LC-MS/MS.
- Анализ белковых взаимодействий методом масс-спектрометрии.
Основные результаты
- Успешная изоляция ARIP4 с FLAG-меткой и ассоциированных белков из клеток HEK 293.
- Окрашивание серебром подтвердило наличие иммунопреципитированных белков.
- Контрольные эксперименты подтвердили специфичность процесса очистки.
- Метод LC-MS/MS позволил идентифицировать предполагаемых партнеров по связыванию ядерного кофактора.
Выводы
- Описанный протокол эффективно идентифицирует белки, взаимодействующие с ядерными кофакторами.
- Данный метод способствует развитию исследований механизмов транскрипционной регуляции.
- Он создает основу для дальнейшего изучения белковых сетей в регуляции генов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Высокопроизводительная идентификация взаимодействий белков-кофакторов ядра с помощью ЖХ-МС/МС имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах поиска новых лекарственных средств и выяснения механизмов работы транскрипционных регуляторных сетей. Данный рабочий процесс позволяет биофармацевтическим группам проверять механистические гипотезы и определять приоритетность мишеней на основе прямых доказательств белок-белковых взаимодействий. Интеграция надежного картирования интерактома на этапе поиска повышает прогностическую уверенность и помогает при принятии решений по сортировке портфеля проектов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет систематически идентифицировать партнеры по связыванию ядерных кофакторов для функциональной валидации мишеней.
- Способствует снижению механистических рисков за счет уточнения путей транскрипционной регуляции.
- Предоставляет прямые доказательства сетей белковых взаимодействий, имеющих значение для регуляции генов.
- Облегчает приоритизацию мишеней с подтвержденными молекулярными взаимодействиями.
Скрининг и разработка метода анализа
- Подготовка валидированных белковых комплексов для последующего количественного анализа методом LC-MS/MS.
- Стандартизация иммунопреципитации и подготовки проб для воспроизводимого профилирования интерактома.
- Получение количественных данных для разработки анализа и обеспечения готовности к скринингу.
- Обеспечение надежной оценки влияния соединений на белок-белковые взаимодействия.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить данные интерактома с транскрипционными механизмами, имеющими отношение к заболеванию, в случаях, когда в патологии задействованы ядерные кофакторы.
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа поиска до доклинической валидации путем картирования сетей регуляторных белков.
- Помогает принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков на основе механистических данных.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод подготовки белка и рабочий процесс LC-MS/MS применим на этапе перехода от начального поиска к идентификации ведущих соединений, обеспечивая базовые данные об интерактоме для последующих трансляционных исследований.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем картирования взаимодействий ядерных кофакторов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для разработки анализов и скрининга соединений.
- Аналитика: обеспечивает идентификацию и количественное определение белковых комплексов с помощью масс-спектрометрии.
- Трансляционные исследования: позволяет сопоставлять данные о молекулярных взаимодействиях с моделями заболеваний, если это применимо.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемый, повторно используемый рабочий процесс для картирования интерактома различных мишеней и программ.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует изоляцию белковых комплексов и анализ методом LC-MS/MS для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала, основывая дальнейшее продвижение на данных о прямом взаимодействии.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию с учетом рисков на основе валидированных молекулярных механизмов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области иммунопреципитации, химии белков и аналитического метода LC-MS/MS.
- Необходим доступ к масс-спектрометрическому оборудованию и аналитической инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки проб и анализа данных.
- Метод может быть адаптирован для различных ядерных кофакторов и систем белков с метками при условии оптимизации протокола.
- Надежность иммунопреципитации зависит от специфичности и качества используемых антител.
