Белок, Способ получения для высокой пропускной способности идентификации белков, взаимодействующих с ядерной кофактора Используя LC-MS / MS Analysis

Общая цель этой процедуры заключается в идентификации белков, взаимодействующих с ядерным кофактором, с помощью LC-MS/MS Analysis. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с транскрипционными механизмами в области регуляции генов. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем идентифицировать белки, взаимодействующие с ядерным кофактором.

Более того, этот метод позволяет нам лучше понять механизмы транскрипционной регуляции целевых ядерных факторов. Соберите HEK 293 клетки, экспрессирующие помеченный флагом ARIP4, через 36 часов после трансвекции, промыв клеточный лист ледяным PBS и собрав клетки с помощью скребка клеток. Переложите клетки в пробирку объемом 1,5 миллилитра, а затем центрифугируйте при плотности 8000 г в течение двух минут при четырех градусах Цельсия.

Аспирируйте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в объеме, в пять раз превышающем объем гранул буфера с высоким содержанием солей. Вращайте смесь в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия. После 20 минут вращения центрифугируйте пробирку при 17 700 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Далее переложите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую пробирку и добавьте буфер для разведения до трехкратного объема надосадочной жидкости. Проведите еще одну цетрифугацию, а затем переложите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую трубку. Во время 10-минутного центрифугирования промойте 50 микролитров шариков против флага с PBS.

Затем центрифугируйте пробирку при 2000 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и повторите шаги промывания сначала 1 моляром гидрохлорида глицина, а затем одним моляром трис гидрохлоридом. Затем дважды постирайте с буфером с низким содержанием соли.

Далее смешайте 50 микролитров промытых шариков с экстрактами целых клеток. Аккуратно вращайте смесь в течение четырех часов при температуре от двух до четырех градусов Цельсия. Затем с помощью затупленного кончика перенесите образец в микроспиновую колонку и дайте раствору просочиться в пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Заморозьте поток в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Далее промойте бусины флажка с буфером с низким содержанием соли пять раз. Чтобы сделать элюирование, поместите колонку в пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при плотности 2000 г в течение одной минуты, чтобы высушить шарики.

Закройте крышкой дно колонки, а затем добавьте 50 микролитров 1 моляра глицина гидрохлорида. Аккуратно встряхивайте смесь в течение 10 минут при комнатной температуре. Через 10 минут поместите колонку в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра и центрифугируйте при плотности 2000 г в течение одной минуты.

Нейтрализуйте элюированный раствор 10 микролитрами одного моляра трис гидрохлорида и хорошо перемешайте путем пипетирования и вортексирования. Добавьте 50 микролитров 100 миллимолярного бикарбоната аммония. 10 микролитров ацетонитрила, два микролитра дитиотреитола и 50 микролитров нейтрализованного образца.

Выдерживать в течение 30 минут при температуре 56 градусов по Цельсию. После инкубации оставьте образец при комнатной температуре на 10 минут. Затем добавьте в образец 10 микролитров 333 миллимоларного йодоацетамида и инкубируйте в темноте в течение 30 минут при 37 градусах С. Добавьте в смесь 10 микролитров трипсина и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия.

На следующий день готовый продукт транспортируется на установку ЖХ-МС/МС или в стороннюю лабораторию масс-спектрометрии для анализа. На этом изображении показано серебряное окрашивание меченого флагом эпитопа ARIP4, экспрессирующегося в клетках HEK 293 после иммунного осаждения специфическим антителом и разделения с помощью электрофореза. В качестве контроля была проведена имитационная очистка клеток HEK 293, которые не экспрессировали экзогенные белки.

Используя наш метод, можно идентифицировать предполагаемые ядерные кофакторы по интересующему их транскрипционному фактору и еще больше углубить наше понимание механизмов регуляции транскрипции.