Быстрое Выделение BMPR-IB + жировая стромальных клеток, полученных для использования в костный дефект модели заживления

Общая цель данного протокола заключается в выделении специфических популяций стромальных клеток, полученных из жировой ткани, и проверке их остеогенной активности с помощью анализа in vivo. Этот метод может быть использован для поиска ответов на ключевые вопросы в области регенеративной биологии челюстно-лицевой области, например, о том, как стволовые клетки из жировой ткани могут быть использованы для создания полностью функциональной костной ткани в местах повреждения костных дефектов. Основным преимуществом данной методики является то, что клетки быстро выделяются из свежей ткани человека; таким образом, клетки не подвергаются воздействию условий культивирования, которые, как известно, изменяют экспрессию генов и маркеров клеточного сервиса.

Значимость данной методики распространяется на пациентов с обширными дефектами костной ткани, вызванными раком, травмами или инфекциями. В будущем может стать возможным выделять популяции ASC и использовать их в регенеративных целях. Визуальная демонстрация этой техники имеет критическое значение, так как освоить создание дефекта свода черепа сложно, прежде всего из-за того, что дефект создается на куполообразной поверхности черепа и в непосредственной близости от твердой мозговой оболочки.

Для данного протокола необходимо собрать подкожный жир из области живота, бока или бедра здорового донора-человека и поместить его в пластиковый контейнер для аспирации. К жиру добавьте равный объем стерильного PBS и перемешайте путем осторожного встряхивания в течение 30 секунд. Дайте водному слою отстояться, затем удалите его с помощью пластической пипетки объемом 10 мл.

Затем перелейте жир в большой пластиковый контейнер и добавьте равный объем смеси для переваривания. Протрите закрытый контейнер с жиром 70% ethanol и запечатайте его парафином. После этого встряхивайте контейнер со скоростью 180 оборотов в минуту в инкубаторе при 37 degrees Celsius в течение 30 минут.

Затем нейтрализуйте действие ферментов, увеличив объем реакционной смеси в два раза путем добавления стандартной среды. Центрифугируйте клетки, осторожно удалите супернатант и ресуспендируйте каждый осадок в 5 миллилитрах стандартной среды. После этого профильтруйте все суспензии через фильтр 100 микрон в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Центрифугируйте фильтрат при температуре 4 °C в течение 15 минут при 300 G. Удалите супернандант и ресуспендируйте осадок в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов комнатной температуры. После создания суспензии выдержите пробу в течение 5 минут для лизиса при комнатной температуре. Затем центрифугируйте пробирку при комнатной температуре в течение 15 минут и завершите этапы разделения согласно текстовому протоколу.

Правильное сортирование клеток имеет решающее значение для данного протокола. Сначала ресуспендируйте клетки в FACS-буфере из расчета 1 миллион клеток на 100 µL и держите их на льду. Затем перенесите не менее 10 миллионов клеток в пластиковую центрифужную пробирку на льду с пометкой BMPR-1B.

Перенесите один миллион клеток в охлажденную на льду пробирку с меткой «неокрашенные» и добавьте к ним один миллилитр FACS-буфера. Оставшиеся клетки пометьте как «несортированные». Затем добавьте антитела в пробирку с BMPR-1B и осторожно перемешайте путем тритурации.

Инкубируйте данную смесь в течение времени, рекомендованного производителем. Затем осадите клетки центрифугированием для последующей сортировки методом FACS и осторожно ресуспендируйте их в 1 мл буфера для FACS. После этого повторите процедуру и ресуспендируйте клетки до концентрации 1 миллион клеток на мл.

Теперь пропустите все три популяции клеток через клеточные фильтры с размером пор 40 micron в стеклянные пробирки для FACS. Используйте 500 microliters буфера для FACS, чтобы смыть оставшиеся клетки с фильтров. Подготовьте две пробирки для сбора антитело-положительных и антитело-отрицательных популяций.

Наполните каждую пробирку двумя миллилитрами стандартной среды для культивирования клеток; на приборе FACS первым образом пропустите неокрашенные клетки и используйте полученные результаты для определения отрицательного гейта для флуоресцентного маркера. Затем, используя сопло диаметром 100 мкм, отсортируйте окрашенные клетки в соответствующие пробирки со стандартной средой. По возможности поддерживайте охлаждение этих пробирок при температуре четырех градусов Celsius в процессе сортировки.

Перейдите к загрузке клеток в скаффолд согласно текстовому протоколу. После проведения анестезии животного удалите шерсть с места хирургического вмешательства и трижды обработайте открытый участок кожи раствором йодоповидона, а затем 70% ethanol. Затем накройте животное стерильным операционным бельем, оставив область хирургического доступа открытой.

Теперь с помощью скальпеля с лезвием № 15 сделайте сагиттальный разрез по срединной линии, охватывающий большую часть дорсальной поверхности черепа. Затем с помощью тонкозубчатого пинцета отодвиньте кожу с правой стороны разреза, чтобы обнажить правую теменную кость. Подготовьте дрель, установив автоклавированное четырехмиллиметровое алмазное трепан-сверло.

Затем просверлите дефект в теменной кости, стараясь не выходить за пределы кости, чтобы не повредить твердую мозговую оболочку. Теперь поместите в дефект скаффолд, содержащий клетки или контрольный раствор, и зашейте разрез кожи непрерывным нейлоновым швом. После этого приступайте к процедурам послеоперационного ухода за мышами согласно текстовому протоколу.

Микро-КТ сканирование дефекта черепа, проведенное в день операции, четко показывает возникший дефект. Повторные сканирования в более поздние временные точки показывают, что дефекты, заселенные BMPR-1B-положительными клетками, закрываются быстрее, чем дефекты с BMPR-1B-отрицательными или несортированными клетками. При количественной оценке заживления как процента полного закрытия раны эта разница становится легко заметной.

Затем фрагменты черепов, содержащие дефекты, подвергли декальцинации и окрашиванию для идентификации новообразованной и контрольной костной регенерации с помощью пентахромного метода Мовата, который позволяет отличить хрящ от кости и определить все промежуточные стадии созревания. По сравнению с несортированными клетками, клетки, положительные по BMPR-1B, оказали сильное влияние на процесс регенерации, наиболее заметное вдоль границ дефекта. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о клиническом потенциале данного эксперимента в области выделения специфичных для пациента ASC и их использования для заживления костных дефектов.

На основе полученных результатов можно провести множество последующих экспериментов для поиска ответов на дополнительные вопросы о заживлении костной ткани, например, использовать FACS для изоляции ASC с различной направленностью дифференцировки, применить микро-КТ для анализа процесса заживления различных типов клеток и тканей с течением времени, а также использовать данную модель дефекта черепа для разработки новых экспериментов по изучению регенерации костей. Не забывайте, что работа с тканями человека может быть чрезвычайно опасной. Обязательно примите соответствующие меры предосторожности, включая использование перчаток, средств защиты глаз и надлежащую утилизацию всех опасных отходов.