Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы составить карту полногеномной программы репликации выбранной клетки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репликации. Например, как программа репликации генома влияет на здоровье и болезнь.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что это быстрый и простой способ отображения времени репликации в различных клетках и условиях. Человеком, который будет писать процедуру отправки факса, будет Дэн Леманн, эксперт по факсу на медицинском факультете. Эта процедура обычно начинается, по крайней мере, с одного-двух умножить на десять-шестую быстро растущие несинхронизированные клетки.

Для адгезивных клеток аспирируйте и промойте каждую пластину тремя миллилитрами PBS без кальция или магния. Откажитесь от PBS и добавьте по одному миллилитру коммерческого Trypsin-EDTA в каждую тарелку. Инкубируйте клетки в течение пяти минут, при температуре 37 градусов Цельсия, пока они не отделятся.

Добавьте три миллилитра питательной среды, чтобы нейтрализовать трипсин, и соберите клетки в 15-миллилитровую коническую пробирку или пятимиллилитровую полистирольную трубку. Держите клетки на льду. Чтобы начать процедуру, центрифугируйте клетки при температуре 300 x G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Аспирируйте и промойте клетки одним миллилитром холодного PBS. Затем раскрутите ячейки вниз. После второй промывки снимите ПБС и снова суспендируйте клетки в 250 микролитрах холодного ПБС.

Осторожно прокручивая трубку, медленно добавьте по каплям 800 микролитров минус 20 градусов Цельсия, 100-процентный этанол высокой чистоты. Это приводит к тому, что конечная концентрация этанола составляет от 70 до 80 процентов. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут.

Начните эту процедуру с центрифугирования неподвижных элементов при температуре 500 x G в течение десяти минут при температуре 4 градуса Цельсия. Тщательно отсадите надосадочную жидкость и дважды промойте клетки одним миллилитром холодного PBS. Отжимайте вниз после каждой стирки.

После второго промывания аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте каждую клетку следующей смесью PI. Один миллилитр PBS содержит пять микролитров по десять миллиграммов на миллилитр РНК, и 50 микролитров по одному миллиграм на миллилитр йодида пропидиума. Отфильтруйте образец через ячейку 35 микрометров в полистирольную пробирку объемом 5 миллилитров.

Заклейте трубку парапленкой. Выдерживать при комнатной температуре от 15 до 30 минут. Храните образцы в темноте, так как йодид пропидиума чувствителен к свету.

Ячейки будут отсортированы с помощью факса. Используйте лазер с яркостью 561 нанометр для дифференцировки клеток на основе интенсивности йодида пропидия. Для достижения оптимальных результатов используйте самую маленькую насадку, рекомендованную для конкретного размера ячейки.

Для большинства клеток она составляет 85 микрометров. Используйте постоянный, медленный поток. Обычно до 300-500 событий в секунду.

Используя гейтинг, дифференцируйте мертвые клетки и субклеточный мусор, построив график FCS в зависимости от SSC. Из жизнеспособных ячеек дифференцируйте дублеты, построив график зависимости ширины SSC от высоты SSC, за которым следует график зависимости ширины FFC от высоты FFC и график высоты йодида пропидиума от ширины йодида пропидида. Для жизнеспособных сигнальных клеток нарисуйте гистограмму интенсивности области йодида пропидия, которая представляет собой содержание ДНК в клетках.

Сортируйте ячейки в холодных условиях на фазы G1 и S. Стробирование для S должно быть широким и вторгаться в фазы G1 и G2. В то время как G1 стробирование должно быть узким и максимально удаленным от S.

Для приходящих типов клеток может быть трудно получить хорошее распределение клеточного цикла. Наиболее критично принимать фазу G1 без ячеек S-фазы. Извлеките трубки с отсортированными ячейками из факсимильного аппарата.

Держите трубки на льду после сортировки. После сортировки клеток ДНК каждого образца очищается с помощью коммерческого набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Затем процедите ДНК с помощью сфокусированного ультразвука до среднего целевого пикового размера в 250 пар оснований.

Проверьте размер чистой ДНК с помощью электрофореза. Рекомендуемое распределение размеров составляет от 200 до 700 пар оснований с пиком примерно в 250 пар оснований. Затем библиотека подготавливается, секвенируется и анализируется в соответствии с текстовым протоколом.

Показана временная карта репликации для всей хромосомы из эмбриональных фибробластов мыши. При ближайшем рассмотрении в районе примерно 50 мегабаз. Точки представляют нормализованное соотношение S к G1 для отдельных окон, а сплошная линия представляет результаты кубического сглаживания и интерполяции.

Высокие значения от S до G1 соответствуют ранней репликации, тогда как низкие значения соответствуют поздней репликации. Красные стрелки указывают на примеры областей репликации с постоянным временем, а зеленые стрелки указывают на временные переходные области. На этом рисунке показана воспроизводимость временных карт репликации между трипкатами эмбриональных фибробластов мыши по сравнению с трипкатами мышиных пре-В-клеток в той же области 18 мегаоснования на одной хромосоме мыши.

Оранжевые стрелки указывают на примеры дифференциальных областей между линиями клеток. Тепловая карта корреляций между шестью образцами еще раз подтверждает результаты. После освоения эта техника от сбора клеток до создания карт может быть завершена за одну неделю при правильном выполнении.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как создавать геномные карты времени репликации для растущих клеток.