Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Общая цель данной процедуры заключается в картировании программы времени репликации по всему геному выбранной клетки. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репликации, например, о том, как программа репликации генома изменяется при нормальном состоянии и при заболевании.

Основным преимуществом данного метода является то, что он представляет собой быстрый и простой способ картирования времени репликации в различных типах клеток и условиях. Автором данной методики выступил Дэн Леманн, эксперт по методу FACS с медицинского факультета. Данная процедура обычно начинается с использования как минимум от 1-2 × 10⁶ быстрорастущих несинхронизированных клеток.

Для адгезивных клеток аспирируйте и промойте каждую лунку тремя миллилитрами PBS без кальция и магния. Удалите PBS и добавьте в каждую лунку один миллилитр коммерческого Trypsin-EDTA. Инкубируйте клетки в течение пяти минут при 37 °C до их открепления.

Добавьте три миллилитра питательной среды для нейтрализации трипсина и соберите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров или полистирольную пробирку объемом пять миллилитров. Храните клетки на льду. Для начала данной процедуры центрифугируйте клетки при 300 x G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия.

Отроссосите среду и промойте клетки одним миллилитром холодного PBS. Затем центрифугируйте клетки. После второго промывания удалите PBS и ресуспендируйте клетки в 250 микrolитрах холодного PBS.

При осторожном перемешивании пробирки на вортексе медленно, по каплям, добавьте 800 µL 100% высокочистого этанола, охлажденного до -20 °C. Это обеспечит конечную концентрацию этанола от 70% до 80%. Инкубируйте клетки на льду в течение 30 минут.

Начните выполнение данной процедуры с центрифугирования фиксированных клеток при 500 ×g в течение десяти минут при температуре 4 °C. Осторожно аспирируйте супернатант и дважды промойте клетки одним миллилитром холодного PBS. После каждой промывки осаждайте клетки центрифугированием.

После второй промывки аспирируйте супернатант и ресуспендируйте каждую клетку в следующей смеси с PI: один миллилитр PBS, содержащий пять микролитров РНКазы в концентрации десять миллиграмм на миллилитр и 50 микролитров пропидийиодида в концентрации один миллиграмм на миллилитр. Профильтруйте образец через сетку 35 мкм в полистирольную пробирку объемом 5 миллилитров.

Загерметизируйте пробирку парафильмом. Инкубируйте при комнатной температуре от 15 до 30 минут. Храните образцы в темноте, так как пропидийиодид чувствителен к свету.

Сортировку клеток проведут с помощью FACS-анализатора. Для дифференциации клеток по интенсивности окрашивания пропидий йодидом используйте лазер с длиной волны 561 нм. Для достижения оптимальных результатов используйте сопло минимального размера, рекомендованного для данного размера клеток.

Для большинства клеток этот показатель составляет 85 микрометров. Обеспечьте стабильный медленный поток. Обычно до 300–500 событий в секунду.

С помощью гейтирования отделите мертвые клетки и субклеточный дебрис, построив график зависимости FCS от SSC. Из жизнеспособных клеток отделите дуплеты, построив график зависимости ширины SSC от высоты SSC, затем график ширины FFC от высоты FFC и график ширины пропидия иодида от высоты пропидия иодида. Для жизнеспособных сигнальных клеток постройте гистограмму интенсивности площади пропидия иодида, которая представляет содержание ДНК в клетках.

Проведите сортировку клеток в условиях охлаждения на фазы G1 и S. Гейт для фазы S должен быть широким и заходить в фазы G1 и G2. Гейт для фазы G1 должен быть узким и располагаться максимально далеко от фазы S.

Для некоторых типов клеток может быть сложно получить четкое распределение по фазам клеточного цикла. Наиболее критически важно выделить клетки фазы G1 без примеси клеток в фазе S. Извлеките пробирки с отсортированными клетками из проточного цитометра.

После сортировки держите пробирки на льду. После завершения сортировки клеток ДНК каждого образца очищают с помощью коммерческого набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Затем ДНК подвергают фрагментации с помощью сфокусированного ультразвукового гомогенизатора до достижения среднего целевого пика размером 250 base pairs.

Проверьте размер фрагментированной ДНК с помощью электрофореза. Рекомендуемое распределение размеров составляет от 200 до 700 пар оснований с пиком примерно на 250 парах оснований. Впоследствии библиотека подготавливается, секвенируется и анализируется согласно текстовому протоколу.

Представлена карта времени репликации всей первой хромосомы эмбриональных фибробластов мыши. При более детальном рассмотрении участка длиной примерно 50 мегабаз точки обозначают нормированное соотношение S к G1 для отдельных окон, а сплошная линия представляет результаты кубического сглаживания и интерполяции.

Высокие значения S к G1 соответствуют ранней репликации, тогда как низкие значения соответствуют поздней репликации. Красными стрелками отмечены примеры регионов с постоянным временем репликации, а зелеными стрелками — регионы временного перехода. На этом рисунке показана воспроизводимость карт времени репликации между тремя повторностями эмбриональных фибробластов мыши в сравнении с тремя повторностями пре-B-клеток мыши в одном и том же регионе размером 18 мегабаз на первой хромосоме мыши.

Оранжевые стрелки указывают на примеры дифференциальных областей между клеточными линиями. Тепловая карта корреляций Спирмена между шестью образцами дополнительно подтверждает полученные результаты. После освоения данная методика — от сбора клеток до построения карт — может быть выполнена за одну неделю при соблюдении всех правил.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как создавать геномные карты времени репликации для растущих клеток.