Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Общая цель данной процедуры — конструирование мультигенных синтетических оперонов под контролем индуцибельной T7 РНК-полимеразы для одновременной экспрессии нескольких белков. Этот метод может быть полезен исследователям в области синтетической биологии и биохимии, позволяя им создавать многобелковые пути или изучать белковые комплексы, зависящие от коэкспрессии различными подходами. Основным преимуществом данной методики является возможность одновременной экспрессии нескольких генов в Escherichia coli из одного плазмидного вектора.

Процедуру из моей лаборатории продемонстрируют Мохамед Хассан, аспирант, и Анжела Томпсон, студент по программе стажировки. После выделения и амплификации интересующих генов согласно текстовому протоколу, подготовьте реакции рестрикции для первого интересующего гена и фактора pMGX. Используйте реакционную смесь объемом 40 µL, содержащую от 0.5 до 1.5 µg ДНК, с добавлением фермента рестрикции.

Инкубируйте реакционные смеси при 37 °C в течение одного часа. Затем добавьте EcoRI и продолжите переваривание еще в течение одного часа. NdeI добавляют перед EcoRI, чтобы обеспечить эффективный гидролиз.

NdeI чувствителен к длине двухцепочечной ДНК с обеих сторон от сайта рестрикции. Первоначальное добавление этого фермента гарантирует расщепление полноразмерной кольцевой плазмиды. Нанесите реакционные смеси для переваривания на 0,7% агарозный гель и проведите электрофорез образцов при напряжении 100 вольт в течение 55 минут.

Затем с помощью чистого скальпеля или лезвия бритвы вырежьте полосы с вставкой и вектором и поместите вырезанные сегменты геля в пробирки объемом 1,5 миллилитра. Очистите ДНК с использованием набора для экстракции из геля в соответствии с текстовым протоколом. Поставьте реакцию лигирования в объеме 20 микролитров, содержащую от 0,15 до 0,5 микрограмма векторной ДНК и соответствующее количество вставки в зависимости от размера гена, а также один микролитр T4 DNA ligase.

В асептических условиях разморозьте на льду аликвоты по 100 µL химически компетентных клеток E.coli штамма XL1-Blue в течение пяти минут. Затем добавьте к клеткам 5 µL реакционной смеси для лигирования, содержащей целевой ген. Инкубируйте трансформированные клетки на льду в течение 30 минут.

Затем подвергните клетки тепловому шоку в течение 45 секунд в водяной бане при температуре 42 °C. После этого поместите трансформированные клетки на лед и добавьте 200 µL холодной среды LB. Оставьте клетки инкубироваться на две минуты.

Инкубируйте клетки при 37 °C при 220 об/мин в течение одного часа, затем высейте 100 µL на чашки с LB-агаром, содержащим соответствующий селективный маркер. Чтобы отобрать колонии потенциальных трансформантов, сравните количество колоний на чашках с отрицательным контролем и на чашках с продуктом лигирования. Желаемое соотношение количества колоний составляет от 1 до 2.

Выберите от четырех до восьми отдельных колоний из каждой реакции лигирования для инокуляции 4 миллилитров среды LB с соответствующим антибиотиком. Инкубируйте культуры при 37 °C и 220 об/мин в течение ночи. С помощью набора для выделения плазмидной ДНК очистите плазмидную ДНК согласно текстовому протоколу и проведите реакции рестрикции в объеме 20 мкл, используя от 150 до 500 нг ДНК и по одному мкл NdeI и EcoRI.

Инкубируйте реакционную смесь для переваривания при 37 °C в течение двух часов. Для вставки гена два в вектор pMGX, содержащий ген один, подготовьте реакционную смесь для переваривания объемом 40 µL, содержащую от 0,5 до 1,5 µg векторной ДНК с первым интересующим геном и 1 µL AVR2. Инкубируйте смесь при 37 °C в течение 1,5 часов, после чего добавьте 1,5 µL щелочной фосфатазы кишечника теленка.

Инкубируйте еще в течение 30 минут. Затем подготовьте реакционную смесь для переваривания объемом 40 мкл, содержащую от 0,5 до 1,5 мкг вектора pMGX со вторым целевым геном. Используйте по одному мкл AVR2 и xpol.

Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение двух часов. Проведите электрофорез продуктов рестрикции в 0,7% агарозном геле. Используя чистый скальпель, вырежьте полосы вставки и вектора, как было показано ранее.

После экстракции плазмидной ДНК и количественного определения образца согласно текстовому протоколу, проведите реакцию лигирования, используя соотношение вставки к вектору 3:1 для гена 2 и pMGX-yfg1. Включите отрицательный контроль с использованием только pMGX-yfg1. Трансформируйте пять микролитров каждой реакции в клетки XL1-Blue, как было продемонстрировано ранее.

Затем сравните количество колоний на чашках с отрицательным контролем и продуктами лигирования. Если на чашке с отрицательным контролем наблюдается большое количество колоний, пересмотрите процедуру обработки CIP. Выберите от четырех до восьми отдельных колоний из реакции лигирования и используйте каждую колонию для инокуляции 4 µL среды LB с соответствующим антибиотиком.

Инкубируйте при 37 °C и 220 об/мин в течение ночи. После выделения и количественного определения плазмидной ДНК, как описано ранее, проверьте эффективность вставки второго гена, подготовив реакцию рестрикции, содержащую от 150 до 500 ng ДНК и 1 µL EcoRI. Инкубируйте реакционные смеси при 37 °C в течение двух часов.

Для целей скрининга рекомендуется использовать EcoRI, однако в некоторых случаях EcoRI может создавать две или более вставки схожего размера, которые трудно различить на геле. Для обеспечения успешного результата следует использовать альтернативный фермент рестрикции, такой как NdeI. Проведите разделение продуктов реакций рестрикции на агарозном геле, чтобы найти полосу, соответствующую размеру вставленного гена 2.

Клонируйте дополнительные гены в плазмиду согласно текстовому протоколу. Для создания полицистронной плазмиды пять генов были сначала клонированы в подходящую плазмиду pMGX A. На этом рисунке показаны pCR-Blunt-yfg1 и pCR-Blunt-yfg2 в плазмиде pMGX A, а также pMGX A, подвергнутая рестрикции с помощью indel и EcoRI. Для клонирования первых двух генов в pMGX A плазмида была подвергнута рестрикции с использованием indel и EcoRI.

После клонирования плазмиды pMGX-yfg1 и pMGX-yfg2 были подвергнуты рестрикции с помощью AVR2 и xpol для подтверждения успешного получения клонов. На данном рисунке показан вектор pMGX-yfg1 после рестрикции AVR2 и вектор pMGX-yfg2 после рестрикции AVR2 и xpol для выделения интересующего гена два. Полученная вставка была клонирована в pMGX-yfg1 с целью создания вектора pMGX-yfg1 два.

Как видно здесь, рестрикция pMGX-yfg1 с помощью EcoRI подтвердила успешное клонирование интересующего гена номер два в pMGX-yfg1. Данное изображение геля демонстрирует различие между рестригированными плазмидами, в которых вставка находилась в правильной или в обратной ориентации. При обратной ориентации вставки два сайта EcoRI располагались бы в непосредственной близости друг от друга, в результате чего фрагменты длиной 50 bp были бы невидимы на геле, а остов стал бы больше.

Наконец, после создания полицистронного экспрессионного вектора с пятью генами, вестерн-блоттинг экспрессированных белков подтверждает, что все пять белков были экспрессированы из одного вектора. Обратите внимание, что белок, кодируемый yfg5, имеет тот же размер, что и yfg1, и не разделяется на геле. После освоения данной методики процесс вставки каждого гена в остов pMGX может быть завершен за три или четыре дня при условии правильного выполнения всех этапов.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости обработки и линеаризации вектора фосфатазой, такой как щелочная фосфатаза кишечника теленка, для дефосфорилирования концов вектора. После выполнения этой процедуры можно провести дальнейшие эксперименты, такие как экспрессия нескольких генов in vivo, чтобы охарактеризовать и использовать биосинтетические пути для получения натуральных продуктов или для изучения белково-белковых комплексов. Данный метод открыл исследователям в области синтетической биологии путь к созданию сложных углеводов и генетически модифицированных штаммов E.Coli.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как реализовать систему экспрессии нескольких генов в E.coli.