Иммуногистохимии на парафиновых срезах Мыши Эпидермис Использование флуоресцентных антител

В эпидермисе. Иммуногистохимия является эффективным средством локализации специфических белков в их экспрессионном компартменте. В этом видео мы демонстрируем надежный метод иммунологической локализации белка в эпидермисе, который мы регулярно используем в нашей лаборатории.

Здравствуйте, я Тэмми из лаборатории доктора Турина здесь, в нижнем здании Оттавского научно-исследовательского института здравоохранения, участвующего в программе по хроническим заболеваниям. Сегодня мы покажем вам процедуру иммуногистохимии с использованием флуоресцентных антител на залитых парафином участках ткани эпидермиса мыши. В нашей лаборатории мы оптимизировали протоколы для иммунолокализующих маркеров эпидермальной дифференцировки с использованием фиксированной ткани BO'S.

В рамках оптимизации мы сохраняем кожу плоской, разложив ее на бумажном полотенце перед фиксацией. Эта процедура включает в себя диссекцию эпидермиса, фиксацию, обезвоживание, заделку парафином и разрезание парафина, регидратацию, демаскацию антигена, разоблачение антител, мечение антител и, наконец, монтирование и визуализацию с помощью эпифлуоресценции. Итак, приступим.

При использовании неонатальных мышей нет необходимости брить кожу задней части. Однако, когда у вас есть старые мыши, у которых есть шерсть, вам нужно сбрить кожу задней части, чтобы она не мешала разрезать участки. Когда вы проводите диссекцию, вы должны быть очень осторожны, чтобы не поместить щипцы в те участки кожи, которые вы хотите использовать для анализа.

Итак, мы просто помещаем щипцы по краю того места, где мы собираемся резать, а затем вы очень осторожно поднимаете, разрезаете эпидермис, не забывая о том, чтобы не касаться области, которую вы хотите использовать для вашего эксперимента. Когда мы фиксируем кожу, мы не хотим, чтобы кожа сворачивалась и оказывалась в трубке. Мы хотим, чтобы он был красивым и плоским.

Чтобы помочь этому, мы кладем кожу на бумажное полотенце так, чтобы она оставалась плоской, пока ее фиксируют. Итак, теперь, когда у нас есть красивая и плоская кожа на бумажном полотенце, мы обрезаем края или обрезаем их, чтобы удалить части, которые мы могли повредить щипцами. А затем вы режете кожу на очень мелкие кусочки примерно два миллиметра на два миллиметра.

Теперь ткань будет зафиксирована. Разрезав кожу на послушные части, вы погружаете ее в раствор бойна. Закупорьте трубочки, оберните трубки перфилом и наденьте их на коромысло.

Для ночной инкубации важно проводить инкубацию в растворе бойна всего от 16 до 18 часов. Более короткие или более длительные периоды фиксации повредят ткани. Инкубация завершена.

Вы прополаскиваете салфетку PBS, а затем проводите серию промываний этанолом с использованием 30%, 50% и 70% спирта. Вы можете видеть, что БО имеет желтый цвет и что по мере того, как вы делаете промывку, по мере того, как благо разбавляется, цвет смывки становится все менее и менее желтым. Каждый раз вы стираете два раза по 30 минут.

После последней промывки в этанол образцы помещаются в свежий 70% этанол и могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшей обработки нескольких вентиляционных отверстий парафина. Внедрение. Чрезмерное использование замороженных тканей приводит к тому, что целостность тканей превосходна, и образцы могут храниться в течение длительных периодов времени. В целом, основные объекты дают более воспроизводимые результаты.

Однако, если у вас есть оборудование и специальный оператор, обладающий опытом, секции могут быть разрезаны собственными силами. Научиться резать хорошие секции – это скорее форма искусства. Поэтому мы используем базовую установку.

После получения слайдов обратно с объекта Core вы можете увидеть, что парафин присутствует на слайдах. В виде тонкой пленки предметные стекла помещаются на решетку, обернутую алюминиевой фольгой, как печеный картофель, и выдерживаются в течение пяти минут при температуре 55 градусов. После окончания инкубации быстро разверните предметные стекла и поместите их в толуол на три промывки по пять минут.

Очень важно помнить, что эти пятиминутные мойки должны быть своевременными, инкубировать слишком долго, и толуол не будет полезен для ваших экземпляров. После трех стирок и толуола сделайте быстрое полоскание в стопроцентном этаноле. Поскольку этанол и толуол образуют осадок, который будет мешать вашему эксперименту, об этом очень важно помнить.

Затем образцы регидратируют путем инкубации на предметных стеклах, пять минут в 95% этаноле, пять минут в 70% этаноле, затем два раза по пять минут в воде. На этом этапе ткани могут быть обработаны для окрашивания с помощью h и e. Для этого мы также используем основную установку.

Для демаскировки антигена бедные 500 мил одноразового цитратного буфера в литровый пластиковый стакан и погрузите ваши предметные стекла. Не забудьте снять металлическую ручку и поставить стакан в микроволновую печь. Грейте в микроволновой печи на высокой мощности два раза по пять минут.

Не забывайте открывать дверцу, чтобы охладить микроволновую печь между двумя инкубациями. После того, как приготовление в микроволновой печи будет завершено, извлеките предметные стекла из буфера для кипящего цитрата и поместите их в посуду для окрашивания с теплой водой. Мы просто используем теплую воду из-под крана, и цель этого - медленно охладить ваши горки от кипения до комнатной температуры.

Теперь вы можете промыть предметные стекла три раза по пять минут в PBS, и мы готовы приступить к иммуногистохимии. Первое, что нам нужно сделать, чтобы начать иммуноокрашивание, это высушить область вокруг наших образцов листом папиросной бумаги. Чтобы предотвратить перекрестное заражение антителами, мы разграничиваем область вокруг наших образцов с помощью блокатора жидкости.

Подготовьте увлажненную камеру, положив в чашку Петри фильтровальную бумагу. Смочите его водой, удалите лишнюю воду и вставьте свои горки. Причина, по которой мы используем увлажненную камеру, заключается в том, чтобы во время инкубационного периода наши предметные стекла не высыхали.

Очень важно, чтобы слайды не высыхали, потому что рисование увеличит ваш фон. Предметные стекла блокируют в это время инкубационным буфером на 30 минут. После блокировки перенесите предметные стекла обратно на решетку для слайдов и инкубируйте в буфере для стирки.

Удалите лишний буфер так же, как вы делали это раньше. Поместите предметное стекло обратно во увлажненную камеру и инкубируйте с первичными антителами в течение одного часа. При комнатной температуре.

Когда часовая инкубация истечет, поместите предметные стекла обратно в решетку для слайдов и промойте с буфером для промывки три раза по 10 минут. После промывания удалите излишки буфера для промывки вокруг образца с помощью папиросной бумаги. Поместите предметные стекла обратно в увлажненную камеру и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре с вторичным антителом, после инкубации со вторичным антителом промойте в трех сменах промывочного буфера по 15 минут каждая.

Далее умываем в три раза по пять минут. В PBS удалите излишки жидкости вокруг образца и протрите PBS с обратной стороны предметного стекла, чтобы закрепить защитные стекла на предметном стекле. Мы используем мобильный телефон с 2,5% DAB co.

Для того чтобы уменьшить выцветание, добавьте в предметные стекла 80 микролитров по каплям. Будьте осторожны, чтобы не занести пузыри. Затем очень медленно опускаем на покровную планку.

Следите за тем, чтобы не оставить после себя пузыри. Пузыри плохи, потому что они часто приземляются прямо на ваш образец, прямо там, где вы хотите сделать снимки после того, как ваш мобильный телефон высохнет. Теперь вы готовы к просмотру своих слайдов.

Вот взгляд на успешное окрашивание с помощью фильтра FITC. В объективе 20x мы видим Clain six, связанную со всеми супербазальными слоями эпидермиса. Наша лаборатория очень заинтересована в экспрессии и локализации клаудинов в эпидермисе.

Что касается узких соединений и формирования барьера проницаемости эпидермиса, мы только что показали вам, как проводить иммуногистохимию на коже мыши. При выполнении этой процедуры важно помнить, что вы хотите, чтобы ваши срезы тканей были плоскими, и что вы хотите убедиться, что ваши срезы не высыхают между инкубациями. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.