Методы исследования эпителиальной транспортной функции белков и выражение в Native кишка и Сасо-2 клеток, выращенных в 3D

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы вырастить кишечные клетки Caco-2 в трех измерениях и продемонстрировать использование камеры Уссинга в исследованиях по регуляции транспортеров серотонина. Показанные здесь методы могут ответить на ключевые вопросы в области транспорта эпителия, например, как регулируется транспортер серотонина в кишечном кишечнике, SERT. Основное преимущество 3D Caco-2 заключается в том, что они точнее отражают межклеточные и межклеточные матриксные взаимодействия между клетками и между клетками, чем монослои.

А метод камеры Уссинга позволяет точно измерять транспортную функцию в эпителии кишечника. Применение 3D-культур Caco распространяется на открытие терапевтических средств, поскольку эти модели позволяют проводить скрининг агентов против заболеваний, связанных с измененной транспортной функцией. Хотя этот метод дает представление о регуляции транспортеров серотонина, он также может быть применен к исследованиям других транспортеров электролитов, таких как натрий и хлорид.

Визуальная демонстрация этих техник имеет решающее значение, так как снятие серомышечного слоя и монтаж слизистой оболочки кишечника в камерах Уссинга сложны для изучения. Демонстрировать процедуры 3D Caco-2 будут инструктор Ишита Чаттерджи и постдок из нашей группы Ануп Кумар. Демонстрацию удаления серомышечного слоя из подвздошной кишки мыши будет проводить Сангита Тьяги, старший научный сотрудник моей лаборатории.

Также монтаж очищенной слизистой оболочки и ее введение в камеры Уссинга продемонстрируют Шубха Приямвада и Ариварасу Натараджан, инструкторы из моей лаборатории. Для начала разморозьте раствор желатинового белка с уменьшенным фактором роста в течение ночи на льду в холодильнике при температуре четыре градуса Цельсия. После размораживания приготовьте один миллилитр, или 500 микролитров аликвот.

В день культивирования камерные горки предварительно охладить на льду. Затем добавьте по 30 микролитров раствора желатинового белка в каждую лунку стеклостекла с восемью камерами и равномерно распределите. При нанесении желатиновой смеси на предметное стекло или планшеты камеры следует соблюдать осторожность, чтобы избежать образования пузырьков, так как клетки могут отделиться.

Поместите чашку для культивирования в инкубатор для клеточных культур с температурой 37 градусов Цельсия на 15–30 минут, чтобы раствор застыл. Затем с помощью трипсина отделите сгущенные клетки Caco-2 от колбы с культурой. Затем подсчитайте клетки в гемоцитометре и центрифугируйте их при 500 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.

Полученную клеточную гранулу повторно суспендировать в среде 3D Caco-2 для получения суспензии нужной плотности. Используя приготовленную клеточную суспензию, засейте 4000 клеток в лунку на предметные стекла стеклянной камеры и дайте им расти в течение 12-14 дней в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы окрашивать клетки, сначала аспирируйте среду и зафиксируйте клетки 400 микролитрами 2%-ного PFA.

Продолжайте фиксировать ячейки в течение 20 минут при комнатной температуре. После двукратной промывки клеток в PBS пропитайте их 0,5% раствором Triton в PBS не дольше 15 минут. Дважды промойте клетки в буфере глицина PBS, а затем промойте проникшие клетки в буфере ПЧ в течение десяти минут при комнатной температуре.

Заблокируйте клетки с помощью 5% нормальной козьей сыворотки в буфере ПЧ. Затем инкубируйте клетки с 200 микролитрами первичного антитела, разведенного в буфере IF с добавлением 1% сыворотки козы, в течение одного-двух часов при комнатной температуре. После инкубации клетки трижды промыть буфером ПЧ.

Инкубировать промытые клетки с 200 микролитрами вторичного антитела, разведенного в буфере IF с добавлением 1% сыворотки козы, в течение одного часа при комнатной температуре. Промойте ячейки с буфером ПЧ трижды в течение десяти минут. Чтобы отсоединить камеру для предметного стекла, сначала поместите предметное стекло в держатель основания предметного стекла, затем проденьте белый подъемник через держатель, пока он не соприкоснется с краем лунок.

Аккуратно потяните за патронник, чтобы снять его с затвора. Используйте закрытый черный ящик для защиты слайдов от света. Установите слайды с медленным средством anti-burn medium и закройте их покровными стеклами.

Дав предметным стеклам высохнуть в течение десяти минут при комнатной температуре, заклейте их лаком для ногтей перед визуализацией. Изолируйте подвздошную кишку мыши в соответствии с процедурой, описанной в текстовом протоколе. Затем с помощью ножниц вскройте кишечник в продольном направлении.

Полученный участок ткани инкубируют в ледяном газообразующем буфере KBR, содержащем один микромолярный индометацин, в течение десяти минут. Приколите срез кишечника длиной около одного сантиметра слизистой стороной вниз к пластине, содержащей 7%-ный агарозный или отвержденный силиконовый эластомер толщиной 0,5 сантиметра. С помощью диссекционного стереомикроскопа с подсветкой дна зачистите серомышечные слои.

Затем разрежьте серомышечный слой перьевым лезвием скальпеля. С помощью тонких щипцов приподнимают край слоя вдоль продольной оси кишечника. Наконец, аккуратно закрепите слизистую оболочку на штифтах ползунка.

Придерживайте очищенную ткань слизистой за края, чтобы избежать разрыва. При монтаже очищенной слизистой оболочки подвздошной кости на штифты ползунка следует соблюдать меры предосторожности, чтобы предотвратить разрыв ткани у булавочных головок и свести к минимуму повреждение краев ткани. Перед обработкой тканей приготовьте раствор Кребса, насыщенный 95% кислорода, 5% углекислого газа.

Затем перелейте раствор в камеру Уссинга. Добавьте в серозальную ванну 10 микромоляров глюкозы в качестве энергетического субстрата и 10 микромолярных маннитов для поддержания осмотического баланса в ванну со слизистой оболочкой. Впоследствии вставьте ползунок с установленной слизистой оболочкой в камеру, чтобы подвергнуть воздействию раствора Кребса как апикальную, так и базолатеральную стороны ткани.

Уравновесьте подвздошную ткань в ванночке в течение десяти минут. Затем предварительно обработайте апикальную сторону 10 микромолярным флуоксетином в течение 30 минут для измерения потока слизистой оболочки в сероз. В конечном итоге, обрабатывайте базолатеральную сторону ткани 10 нанограммами на миллилитр TGF beta 1 в течение одного часа, а затем инкубируйте апикальную сторону 20 наномолярами тритианового 5-HT в течение 30 минут.

Чтобы рассчитать скорость потока слизистой оболочки к серозальному, соберите 0,75 миллилитровых аликвот из серозального резервуара, заменив их идентичными объемами среды для ванны для предотвращения перепадов гидростатического давления на слизистой оболочке. Чтобы количественно оценить накопленный в ткани тритиатированный 5-НТ, удалите слизистую оболочку из ползунка. Промойте его один раз ледяным буфером KRB и поместите в стеклянную пробирку для культуры.

Инкубируйте слизистую оболочку в 0,5 миллилитрах 10% KOH в течение ночи при 37 градусах Цельсия для лизирования тканей. Затем измерьте радиоактивность в 150 микролитрах аликвот лизатов в трех экземплярах с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Используя метод Брэдфорда, измерьте концентрацию белка в трех-пяти микролитрах аликвот лизатов.

Здесь показаны цисты Caco-2, выращенные в 3D-культуре, окрашенной на актин, и 3D-цисты Caco-2, окрашенные одновременно на актин, ядра и белок SERT. SERT видна в просветной мембране и в субапикальных компартментах. Для дальнейшего подтверждения преимущества 3D-сфер Caco-2 перед 2D-монослоями Caco-2 был проведен вестерн-блот-анализ экспрессии белка SERT.

Результаты показали повышенную экспрессию белка SERT в 3D-сферах Caco-2 по сравнению с двумерными клетками Caco-2. Наконец, была использована система камер Уссинга, чтобы показать, что TGF beta увеличивает поток слизистой оболочки до серозного, отражая повышенное поглощение 5-HT из люминальной мембраны и повышенное накопление 5-HT, наблюдаемое в слизистой оболочке подвздошной кишки. Такие результаты подтверждаются наблюдаемой чувствительностью поглощения 5-HT к лечению флуоксетином, что соответствует экспрессии SERT на люминальной мембране.

После освоения этой техники стриппинга и монтирования слизистой оболочки подвздошной кишки можно завершить за 15 минут. Применяя эту процедуру, важно помнить, что после изъятия из организма животного экстравио кишечный препарат имеет ограниченную жизнеспособность и может сохраняться до трех часов. 3D кисты Caco-2 могут быть использованы для различных исследований, таких как события мембранного транспорта, экспрессия генов или белок-белковое взаимодействие эпителиальных транспортеров.

После своего развития 3D-техника Caco-2 открывает путь исследователям в области кишечного транспорта к изучению движения жидкости и изучению патофизиологии дариальных заболеваний. Не стоит забывать о том, что работа с радиоактивностью может быть крайне опасной, и всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование СИЗ и надлежащие процедуры дезактивации. После просмотра этого видео вы сможете выращивать клетки Caco-2 в 3D-культурах и использовать эти культуры для исследования экспрессии эпителиального транспортера.

Вы также сможете использовать камеру Уссинга для изучения транспортной функции серотонина в нативном кишечнике мыши.