Генетические скрещивания

Генетическое скрещивание – это целенаправленное спаривание двух особей, в результате которого происходит объединение генетического материала в потомстве. Скрещивание может быть выполнено во многих модельных системах, включая растения, дрожжи, мухи и мышей, и может быть использовано для анализа генетических процессов или создания организмов с новыми признаками.

В этом видео будут рассмотрены некоторые принципы генетических скрещиваний, рассмотрен один из методов выполнения скрещиваний, известный как тетрадный анализ, и обсуждены несколько применений этого метода.

Во-первых, давайте познакомимся с основными принципами наследования, которые делают возможными генетические скрещивания.

Фенотип организма, или композиция признаков, зависит от его генетического состава или генотипа. У большинства организмов, размножающихся половым путем, родительское поколение производит гаплоидные гаметные клетки, которые имеют по одной копии каждой отдельной хромосомы. Затем они сливаются во время спаривания, чтобы получить диплоидное потомство с двумя гомологичными копиями каждой хромосомы. Если обе хромосомы содержат один и тот же аллель или вариантную форму гена, то организм является «гомозиготным» в этом генетическом локусе; в противном случае он "гетерозиготный."

Чтобы начать цикл заново, диплоидный организм снова генерирует гаплоидные гаметы посредством мейоза. Во время этого процесса две гомологичные хромосомы подвергаются «рекомбинации», когда между парой происходит обмен битами эквивалентных последовательностей. Этот процесс перетасовывает родительские аллели, унаследованные каждым потомством, тем самым увеличивая их генетическое разнообразие.

Одним из первых людей, которые начали проводить систематические генетические скрещивания, был «отец генетики» Грегор Мендель. Используя легко манипулируемое растение горох и изучив ряд признаков с последовательными моделями наследования, Мендель смог вывести три основных закона наследования, которые легли в основу генетики.

Первый закон Менделя — это закон единообразия, который гласит, что гетерозиготное потомство первого, или F1, поколения двух гомозиготных особей будет иметь фенотип только одного родителя. Аллель, устанавливающий этот фенотип, называется «доминантным», в то время как «скрытый» аллель является «рецессивным». Теперь мы знаем, что отношения доминирования часто менее четкие, с такими случаями, как неполное доминирование, когда гетерозиготы экспрессируют смешанный фенотип; и кодоминация, где проявляются оба фенотипа.

Закон сегрегации гласит, что одна аллель случайным образом присваивается каждой гамете. Заметив, что потомство F2 от самооплодотворения гетерозиготных особей F1 продемонстрировало фенотипическое соотношение 3:1, но что две из фенотипически доминирующих особей на самом деле являются гетерозиготами, Мендель пришел к выводу, что два родительских аллеля должны наследоваться отдельно. Сегодня мы знаем, что сегрегация происходит во время мейоза, когда две гомологичные хромосомы диплоидного родителя случайным образом делятся на гаплоидные дочерние клетки, каждая из которых наследует один из двух аллелей.

Третьим законом Менделя является закон независимого ассортимента, который гласит, что индивидуальные признаки наследуются независимо. Теперь мы знаем, что абсолютная независимость существует только для признаков, контролируемых генами на отдельных хромосомах в гаплоидном наборе, которые независимо распределяются по дочерним клеткам во время мейоза. Для двух генов на одной и той же хромосоме расстояние между ними обратно пропорционально вероятности того, что они рекомбинируются на разные гомологичные хромосомы, и, следовательно, насколько вероятно, что они будут унаследованы вместе у одного и того же потомства. Таким образом, анализ четырех мейотических продуктов диплоидного организма дает ученым возможность составить карту расположения генов.

Рассмотрев принципы, лежащие в основе генетических скрещиваний, давайте рассмотрим протокол анализа тетрад.

Этот метод обычно применяется к определенным одноклеточным водорослям или грибам, таким как дрожжи, для препарирования четырех гаплоидных мейотических продуктов, или спор, которые у этих видов остаются вместе как «тетрады» в одном клеточном теле.

Для проведения тетрадного анализа на дрожжах нужные штаммы сначала выращивают на соответствующих средах. Дрожжевым клеткам из отдельных колоний разрешается спариваться, например, путем наложения каждого штамма в виде перекрестного узора на новую пластину. Затем эту пластину реплицируют на селективную среду, чтобы выделить только диплоидный продукт креста.

Отобранные диплоидные клетки выращивают на бедных питательными веществами средах, чтобы вызвать спороношение и образование тетрад. Аски, которые представляют собой структуры, удерживающие тетрады спор, расщепляются в растворах, содержащих фермент зимолязу. После разложения отдельные аски обрабатываются с помощью микроскопа, препарирующего тетрады. Они располагаются в определенных местах на пластине роста и разрушаются, чтобы освободить отдельные споры. Они могут быть размещены в виде сетки, где каждая спора будет генерировать отдельную колонию, которую можно будет дополнительно проанализировать.

Теперь, когда вы знаете, как выполняется тетрадный анализ, давайте рассмотрим некоторые из многих применений или модификаций этого метода.

Ручное препарирование тетрад занимает много времени, и исследователи разработали высокопроизводительные альтернативы, такие как секвенирование тетрад с помощью штрих-кодов. В этом методе диплоидное потомство дрожжевого скрещивания было преобразовано с помощью библиотеки плазмид, каждая из которых содержит короткую, уникальную последовательность, известную как «штрих-код», который действует как идентификатор для каждого потомства. Плазмиды также экспрессируют GFP, что позволяет отбирать дрожжи asci с помощью проточной цитометрии и сортировать их на агаровых планшетах. Аски были массово лизированы на планшетах, и спорам было позволено вырасти в небольшие колонии. Затем колонии были случайным образом распределены по 96-луночным планшетам для генотипирования. Уникальный штрих-код последовательности позволяет исследователям сгруппировать четыре колонии, возникшие из спор каждой тетрады.

Генетические скрещивания также могут быть использованы для получения дрожжевых клеток с большим количеством делеций генов. В процессе зеленого монстра гаплоидные мутантные дрожжи, несущие различные делеции генов, маркированные GFP, спариваются и спорулируются. Эти гаплоидные потомки, некоторые из которых несут делеции, унаследованные от обоих родителей, сортируются с помощью флуоресцентно-активируемой проточной цитометрии, где было показано, что интенсивность GFP коррелирует с количеством делеций, присутствующих в конкретном штамме дрожжей. Эти отобранные клетки затем культивировали и повторно скрещивали. Повторение этого цикла привело к образованию штаммов дрожжей, содержащих многочисленные делеции.

Наконец, генетические скрещивания были адаптированы для использования во многих модельных системах, таких как вызывающий малярию внутриклеточный паразит Plasmodium. Поскольку паразит может размножаться только в других клетках, все этапы скрещивания должны быть выполнены у мышей или комаров, естественных хозяев и переносчиков паразита соответственно. Здесь мыши были инфицированы двумя уникальными штаммами Plasmodium на стадии кровяного паразита. Затем паразиты передавались комарам через кровь, а оказавшись внутри, они созревали в гаметы, которые оплодотворялись, образуя диплоидные зиготы. Зрелые спорозоиты затем были собраны у комаров и использованы для заражения наивных мышей, где паразиты размножались для выделения представляющего интерес потомства.

Вы только что посмотрели видео JoVE о генетических скрещиваниях. В этом видео мы рассказали о принципах наследования, о том, как можно проанализировать генетические скрещивания у некоторых организмов с помощью вскрытия тетрад, а также о некоторых современных приложениях. Как всегда, спасибо за просмотр!