Генетический скрининг

Генетический скрининг является важным инструментом для идентификации генов и мутаций, ответственных за фенотипы, представляющие интерес, а также для понимания того, как гены функционируют в биологических процессах. Скрининг выполняется в различных модельных системах, включая мух, червей, растения и клеточные культуры, и привел к открытию новых клеточных путей и потенциальных мишеней для лекарств от болезней человека.

В этом видео будет представлен обзор различных типов генетического скрининга, объясняются два общих протокола скрининга у червей-нематод и показаны некоторые способы применения скрининга в лабораториях в настоящее время.

Во-первых, давайте рассмотрим, что такое генетический скрининг и что мы можем с его помощью узнать.

Генетический скрининг основан на прямой или обратной генетике. При прямом или «классическом» генетическом скрининге мутации случайным образом генерируются в ДНК организма с помощью радиации или химических веществ, известных как мутагены. Дополнительные основания также могут быть вставлены в ДНК с использованием, например, последовательностей, известных как транспозоны, которые могут интегрироваться в различных местах генома и нарушать функцию генов, в которые они встраиваются. Эти типы вставок часто сочетаются с флуоресцентными репортерами, что позволяет напрямую обнаруживать мутировавшие организмы. Когда обнаруживается, что мутант демонстрирует фенотип, представляющий интерес, неизвестный ген, который был мутирован, может быть затем отображен на хромосоме и секвенирован.

Противоположным подходом к скринингу является обратный генетический скрининг, при котором исследователи нарушают экспрессию многих генов-кандидатов, а затем ищут мутантные фенотипы, полученные в результате этих манипуляций.

В дополнение к мутациям «потери функции», которые нарушают активность гена, генетический скрининг также может быть основан на мутациях «усиления функции», которые вызывают увеличение экспрессии или функциональности гена. Это может быть достигнуто путем случайной вставки в геном регуляторных элементов гена, что будет стимулировать сверхэкспрессию гена, из которого элемент вставляется вверх по течению.

В качестве альтернативы, в методе, называемом «скринингом экспрессии», исследователи используют библиотеки плазмид, которые содержат кодирующие белки последовательности различных генов, и вводят их в клетки, где гены будут высоко экспрессированы. Полученные фенотипы затем могут быть использованы для понимания функции генов.

Чтобы получить больше информации об известном гене или мутации, можно использовать скрининг модификаторов. Супрессорный скрининг начинается с охарактеризованного мутанта и выявляет дополнительные мутации, которые делают фенотип мутанта менее тяжелым. Супрессорная мутация, обнаруженная в том же гене, что и исходная мутация, называется «внутригенной», в то время как супрессорная мутация, расположенная в другом гене, считается «экстрагенной».

Напротив, энхансерный скрининг выявляет дополнительные мутации, которые увеличивают тяжесть мутантного фенотипа. Они могут быть полезны для определения генов, которые являются избыточными или могут функционально взаимодействовать. Если комбинация двух или более мутаций приводит к серьезному нарушению роста или даже смерти, это состояние называется «синтетической болезнью или летальностью». Скрининг на синтетические больные или смертельные мутации выявляет гены, которые функционируют в избыточных, но важных биологических путях. Это особенно полезно, например, при идентификации нескольких генных продуктов, на которые можно одновременно нацеливаться с помощью лекарств для уничтожения раковых клеток.

Теперь, когда вы понимаете некоторые распространенные стратегии генетического скрининга, давайте рассмотрим общий протокол прямого скрининга в популярном модельном организме, черве-нематоде.

В этом примере химический мутагенез будет осуществляться с помощью этилметансульфоната или EMS, который работает путем химической модификации нуклеотидов гуанина, заставляя их ненадлежащим образом соединяться с тимином в последующих раундах репликации ДНК. Поскольку EMS является мутагеном и возможным канцерогеном, с ней следует работать только в двойном слое перчаток, а работу следует проводить в вытяжном шкафу.

Для начала отбирается, промывается и собирается большое количество червей на последней личиночной стадии. Затем к червям добавляют EMS, и червей инкубируют в течение нескольких часов, чтобы вызвать мутации. После мутагенеза EMS следует удалить из червей и инактивировать гидроксидом натрия. Затем червей многократно промывают в питательной среде и наносят на агаровые пластины.

Затем здоровых на вид червей пересаживают на новые тарелки, только что засеянные бактериями в качестве источника пищи, и позволяют им размножаться. Потомство второго поколения может быть визуально проверено на мутантные фенотипы, такие как дефекты локомотива.

Теперь давайте рассмотрим протокол обратного генетического скрининга у нематод.

Общий подход к проведению обратного скрининга у червей заключается в том, чтобы скармливать животным библиотеку бактерий, экспрессирующих двухцепочечные РНК, по одной на каждый бактериальный штамм, что будет сбивать экспрессию одного гена-кандидата у червей. Эти библиотеки часто коммерчески доступны и могут быть субкультурированы для использования на экранах.

Для начала культивируются отдельные колонии бактерий, содержащие отдельные библиотечные клоны, и индуцируется производство двухцепочечной РНК. Затем культуры высаживают на отдельные лунки планшета со средой для роста нематод и дают им высохнуть в стерильном вытяжном шкафу.

Затем червей насаживают на бактерии и оставляют питаться во влажной камере в течение трех-четырех дней. Мутантные фенотипы могут быть быстро замечены либо у исходных червей, помещенных на кормовые пластины, либо у потомства первого поколения.

Теперь, когда вы увидели, как выполняется прямой и обратный генетический скрининг, давайте обсудим некоторые из их текущих применений.

Некоторые генетические скрининги используются, чтобы помочь ученым идентифицировать белки, которые физически взаимодействуют или функционируют в одном и том же молекулярном пути. В этом эксперименте ученые разработали высокопроизводительный скрининг на основе микроскопии, чтобы обнаружить новые трансмембранные рецепторы, которые активируют определенную сигнальную молекулу. Сверхэкспрессируя различные гены в эмбриональных клетках почек человека, содержащие флуоресцентно помеченный сигнальный белок, они смогли отслеживать, какие рецепторы влияют на субклеточную локализацию белка.

Еще одним применением генетического скрининга является характеристика генно-лекарственных взаимодействий. Здесь была сгенерирована библиотека мутантных дрожжей с использованием крупномасштабного случайного мутагенеза с вставками транспозонов. Затем каждый мутантный штамм выращивали в присутствии препарата. Рост каждого штамма количественно оценивали с помощью ПЦР с последующим анализом микрочипов или секвенирования, чтобы определить, какие мутанты, по сравнению с немутировавшими контрольными группами, были чувствительны к медикаментозному лечению.

Наконец, скрининг может быть использован для понимания генов и молекулярных сетей, нарушенных при заболевании человека. В этом эксперименте исследователи культивировали нейроны в присутствии вирусов, кодирующих РНК, чтобы подавить экспрессию многих различных генов-мишеней. Затем был использован автоматизированный анализ иммуноокрашенных клеток для выявления генов, влияющих на физические свойства нейронов, таких как рост нейритов. Этот подход позволил успешно идентифицировать гены, участвующие в нейродегенеративных заболеваниях.

Вы только что посмотрели видео JoVE на генетических экранах — мощный метод выявления генов, участвующих в ключевых биологических процессах. В этом видео мы рассмотрели некоторые основные типы генетических скринингов, общие протоколы для проведения как прямого, так и обратного скрининга, а также обсудили, как эти методы применяются в лабораториях сегодня. Спасибо за просмотр!